Desenvolvimento e padronização do Dot-ELISA usando peptídeos recombinantes para o diagnóstico sorológico de Neospora caninum

A neosporose e reconhecida como uma das maiores causas de aborto e perdas neonatais em bovinos de leite e corte em todo o mundo. Nos ultimos anos esta doenca tem atraido o interesse de pesquisadores com foco na epidemiologia e metodos eficazes de diagnostico desta doenca. No presente estudo objetivou-se desenvolver e padronizar um teste Dot-ELISA para o diagnostico sorologico de Neospora caninum com um peptideo recombinate como antigeno, visando o desenvolvimento de um kit para diagnostico a campo. O peptideo recombinante (rNcGRA1) foi desenhado com base na metodologia de genetica reversa de epitopos antigenicos originados de uma proteina de grânulos densos de N. caninum, e sintetizado pela GenScript (USA). Produzido mediante o processo fermentativo em leveduras Pichia pastoris KM71. Para a padronizacao do Dot-ELISA, membranas de nitrocelulose de 0.22µm foram sensibilizadas com 1µL do antigeno e posteriormente os soros foram diluidos em solucao de lavagem e incubados durante 1 hora. A revelacao foi feita mediante a adicao de Proteina G marcada com peroxidase por 30 minutos, seguido da solucao reveladora a base de 3,3’-Diaminobenzidine (DAB). Logo apos a padronizacao foram testados 44 soros bovinos diagnosticados por imunofluorescencia indireta (RIFI), obtendo-se uma concordância nos resultados do teste de 95,5% e uma sensibilidade e especificidade de 100% e 92% respectivamente. Quanto ao Kit para diagnostico a campo na Plataforma Tecnologica RapidFlow-Through Miriad®, o peptideo rNcGRA1 apresentou marcacoes visiveis ao reagir com os soros positivos, e nao apresentou marcacoes usando os soros negativos. Este estudo e o primeiro a utilizar peptideos recombinantes e mostrar-se eficiente para o diagnostico sorologico de bovinos naturalmente infetados por N. caninum.