Aplicação de abordagens bioinformáticas no estudo da estrutura populacional de Trypanosoma cruzi

A doenca de Chagas, causada pelo protozoario Trypanosoma cruzi, apresenta diferentes manifestacoes clinicas, resultantes de uma interacao complexa entre fatores ambientais e geneticos tanto do hospedeiro quanto do parasito. Com relacao aos fatores geneticos do parasito, uma variedade de estudos biologicos e moleculares revelou uma substancial variabilidade genica entre populacoes de T. cruzi. De fato, em 2009, O taxon T. cruzi foi subdividido em seis linhagens ou DTUs principais (TcI-VI). Os aspectos epidemiologicos associados as diferentes linhagens ainda nao estao bem definidos, mas ja ha evidencias de associacao, pelo menos parcial, com a distribuicao geografica, ciclos de transmissao e aspectos clinicos da doenca. Todavia varios aspectos da estrutura populacional do parasito ainda necessitam esclarecimentos. Por exemplo, o modo de reproducao, a origem das seis linhagens e as relacoes com os seus aspectos epidemiologicos. No presente trabalho procurou-se desenvolver ou aperfeicoar procedimentos moleculares, e computacionais que permitissem investigar e dissecar a complexidade da estrutura populacional de T. cruzi. Para tanto, foram propostos os seguintes objetivos (i) investigar a estrategia de reproducao do T. cruzi; (ii) buscar novas metodologias de caracterizacao molecular capazes de diferenciar as diferentes linhagens de T. cruzi em futuros ensaios multiplex de PCR; (iii) sequenciar o genoma de uma linhagem ainda nao disponivel nos bancos de dados publicos e realizar uma analise comparativa com seus dados genomicos a fim de resolver a origem ancestral das seis linhagens filogeneticas propostas; (iv) e, por fim, desenvolver uma metodologia computacional de agrupamento capaz de reconhecer padroes responsaveis pela divisao das linhagens e gerar regioes candidatas para o desenho de iniciadores para novos ensaios de caracterizacao molecular. Baseados em marcadores nucleares e mitocondriais e em parâmetros de genetica populacional, analisamos dois grupos de isolados de T. cruzi: um proveniente diferentes regioes da America Latina e outros obtidos exclusivamente de pacientes do Estado de Minas Gerais. Nossos resultados, ao contrario daqueles majoritariamente encontrados na literatura, nao suportam uma estrutura de populacao essencialmente clonal para T. cruzi, ao menos para TcII coexistindo em uma mesma area geografica, sugerindo que as trocas geneticas entre cepas estreitamente relacionadas geograficamente sao mais frequentes do que inicialmente esperado. Baseado na tecnica de caracterizacao alelo especifica BI-PASA, nos selecionamos uma variacao no gene NAD desidrogenase subunidade I (ND1) de T. cruzi, e nossos resultados demostraram que esta metodologia foi eficaz, sendo rapida e mais barata, tornando-se uma boa candidata a ser utilizada em futuros ensaios de caracterizacao destes haplotipos. O genoma do clone da cepa 231 pertencente a linhagem TcIII foi sequenciado e para a montagem foi desenvolvida uma abordagem de montagem combinada de diferentes metodologias capaz de melhorar a acuracia da montagem deste genoma de conteudo altamente repetitivo. Posteriormente, nos realizamos uma analise comparativa entre o genoma da cepa 231 montado e os demais disponiveis em bancos de dados e selecionamos genes altamente conservados, que foram utilizados em analises filogeneticas. Os resultados obtidos apontam para uma nova hipotese de origem das seis linhagens filogeneticas de T. cruzi e nos permitiram concluir que a linhagem TcIII, diferentemente do que foi proposto por diversos trabalhos, nao e uma linhagem hibrida. Sequencias genicas codificadoras de proteinas altamente repetivivas e variaveis, como a amastina, de diferentes linhagens do parasito foram analisadas em um script criado por nosso grupo baseado em decomposicao de valores singulares e K-means juntamente com uma analise de regressao logistica, resultando na geracao de regioes candidatas responsaveis pela divisao destas sequencias em grupos, que foram similares a divisao filogenetica esperada. Esta metodologia podera ser aplicada futuramente a outros grupos genicos para elaboracao de novas metodologias de caracterizacao molecular. As metodologias desenvolvidas e os resultados obtidos neste trabalho contribuem para um melhor entendimento da complexidade da estrutura populacional de T. cruzi.