Kooperative Wechselwirkungen von Transkriptionsfaktoren und Histonen mit Promotorelementen der Phosphatasegene PHO5 und PHO8 in Saccharomyces cerevisiae

In der vorliegenden Arbeit wurde die Wechselwirkung zwischen Transkriptionsfaktoren und Elementen der Chromatinstruktur bei der Regulation zweier Promotoren des Phosphatase-systems der Hefe Saccharomyces cerevisiae untersucht. Als Modellsystem wurden die Promotoren der Gene PHO5 und PHO8 gewahlt, die fur eine saure bzw. eine alkalische Phosphatase kodieren und durch Phosphatmangel induziert werden. Wahrend der Induktion findet eine charakteristische Chromatin-Umordnung am Promotor statt, die sich bei PHO5 uber einen Bereich von vier Nukleosomen ausdehnt, bei PHO8 jedoch signifikant geringer ist. Fur die transkriptionelle Aktivierung sind insbesondere zwei Transkriptionsfaktoren notig: das bHLH-Protein Pho4 und das Homoodomanenprotein Pho2. Der PHO5-Promotor besitzt zwei Pho4-Bindestellen, die den regulatorischen Elementen UASp1 und UASp2 entsprechen. Wahrend UASp1 in einem hypersensitiven Bereich zwischen den Nukleosomen liegt, ist UASp2 intranukleosomal lokalisiert. Mutagenese einer der beiden Bindestellen fuhrte zu einer zehnfachen Abnahme der Promotoraktivitat, wahrend Mutagenese beider Stellen die Induzierbarkeit des Promotors vollig aufhob. Um die Bedeutung der Lokalisation der UAS-Elemente im Chromatin zu analysieren, wurde ein Operator fur den a2-Repressorkomplex oberhalb des PHO5-Promotors eingebaut. Dieser Repressorkomplex bildet im Kontext bestimmter Promotoren eine zum a2-Operator benachbarte repressive Chromatinstruktur mit basenpaargenauer Nukleosomenposition aus. Im PHO5-Promotor fuhrte der Einbau dieses Operators zur Repression der Promotoraktivitat und einer leicht verminderten Chromatinzuganglichkeit. Demnach kann der a2-Operator transkriptionshemmende Strukturen initiieren, wobei die Repression durch verstarkte Chromatinkondenation und moglicherweise durch die Rekrutierung von reprimierenden Mediatorproteinen des RNA-PolymeraseII-Holoenzyms vermittelt wird. Durch Deletionen von Bereichen zwischen dem a2-Operator und den UAS-Elementen konnten Nukleosomen wie das Nukleosom -2 zwar stabilisiert, aber nicht gezielt verschoben werden. Rekonstitutionsexperimente mit einem 180 Bp-DNA-Fragment, das den Bereich des Nukleosoms -2 enthielt, zeigten zwar einen gewissen Beitrag der Sequenz zur Histon-DNA-Bindung, dieser allein kann jedoch keinesfalls die Positionierung erklaren, vielmehr scheinen Wechselwirkungen der Histone mit anderen Chromatinkomponenten entscheidenden Anteil zu haben. Zusammenfassung E -144-Der Mechanismus der Chromatin-Umordnung am PHO5-Promotor durch die Transkriptions-faktoren Pho4 und Pho2 wurde zunachst durch in vitro Experimente unter Verwendung von rekombinantem Pho2-Protein analysiert. Es konnten mehrere Pho2-Bindestellen verschie-dener Affinitat im PHO5-Promotor gefunden werden. Eine der hochaffinen Pho2-Binde-stellen uberlappt grostenteils mit der Pho4-Bindestelle UASp1. Die kooperative DNA-Bindung der beiden Proteine an ihre uberlappenden Bindestellen resultierte in einem hochaffinen ternaren Komplex. Auch am UASp2-Element, bei dem zwei Pho2-Bindestellen eine Pho4-Bindestelle flankieren, findet eine kooperative Bindung von Pho2 und Pho4 an die DNA statt. Durch Mutation der mittels in vitro-Footprints entdeckten Pho2-Bindestellen konnte gezeigt werden, das diese zur Promotoraktivitat beitragen. Sie sind nicht nur wichtig, um Pho2 an den Promotor zu rekrutieren, sondern ermoglichen auch die kooperative DNA-Bindung mit Pho4 uber direkte Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen Pho2 und Pho4. Eine Pho2-Interaktionsdomane von Pho4 ist essentiell fur die Aktivierung des PHO5-Promotors, wie durch Deletionsanalyse demonstriert wurde. Die kooperative DNA-Bindung dieser Faktoren scheint demnach sehr wichtig fur die Transkriptionsregulation des PHO5-Gens zu sein. Getrennte Untersuchungen von UASp1 und UASp2 in einem CYC1-Promotor-Kontext zeigen einen eindrucksvollen Unterschied zwischen den zwei UAS-Elementen und verdeutlichen die duale Rolle von Pho2 in der Aktivierung des PHO5-Promotors. Es ist in entscheidender Weise fur die Rekrutierung von Pho4 zur UASp1-Stelle notig und verstarkt daruber hinaus das Pho4-Aktivierungspotential, wahrend es an der UASp2-Stelle eher nur das Pho4-Aktivierungspotential erhoht. Trotz der koordinierten Regulation beider Promotoren ist der PHO8- fast 10mal schwacher als der PHO5-Promotor. Von den beiden Pho4-Bindestellen am PHO8-Promotor, welche fruher in vitro bestimmt worden waren, ist nur eine in vivo funktional. Der Austausch des inaktiven PHO8-UASp1-Elements durch das UASp1-Element des PHO5-Promotors erhoht das Ausmas der Chromatinoffnung im Bereich der Nukleosomen -3 und -2 und ergibt einen zweifachen Anstieg der Promotoraktivitat. Im Gegensatz dazu verhindert der Austausch der hochaffinen UASp2-Stelle durch die entsprechende UASp2-Stelle von PHO5 die Chromatin-umordnung und Promotoraktivierung, obwohl eine effiziente Bindung von Pho4 an dieser Stelle besteht. Diese Daten zeigen, das eine quantitative Bindung von Pho4 an ein UAS-Element ohne irgendeine Chromatin-Umordnung und Promotoraktivierung moglich ist. Die Deletion der Promotorregion, die normalerweise von den Nukleosomen -3 und -2 bedeckt wird, ergibt einen zweifachen Anstieg der Promotoraktivitat, was die repressive Rolle dieser Zusammenfassung -145-Nukleosomen anzeigt. Die gute Korrelation zwischen Promotoraktivitat und Ausmas der Chromatin-Umordnung impliziert, das fur das Ausmas der PHO8-Induktion im Vergleich zu PHO5 die Qualitat der Histon-DNA-Wechselwirkung eine Rolle spielt, da auch bei Einfuhrung des PHO5-UASp1-Elements in den PHO8-Promotor keine vollstandige Chromatinoffnung beobachtet wird. Obwohl Pho4 in Pho2-unabhangiger Weise am PHO8-Promotor bindet und Chromatin remoduliert, ist Pho2 dennoch an der Promotoraktivitat durch Erhohen des Aktivierungspotentials von Pho4 beteiligt, ahnlich wie am UASp2-Element des PHO5-Promotors. Die Ergebnisse dieser Arbeit haben die Rolle des Homooproteins Pho2 bei der Induktion des PHO5- und PHO8-Promotors aufgeklart und unterstreichen die enorme Bedeutung des kooperativen Bindens der Transkriptionsfaktoren Pho4 und Pho2. Zum anderen haben sie das Wechselspiel zwischen Transkriptionsfaktoren und der Chromatinstruktur am Beispiel dieser Promotoren besser definiert.