Functional importance of novel nucleotide variations in the CYP21A2 gene : Importância funcional de novas variações nucleotídicas no gene CYP21A2

A Hiperplasia Adrenal Congenita (HAC), uma das desordens autossomicas recessivas mais frequentes, e causada pela deficiencia de enzimas esteroidogenicas envolvidas na biossintese do cortisol. Uma consequencia disto e o desvio da sintese para a producao de hormonios androgenicos. Na forma classica da HAC, a exposicao pre-natal intrauterina ao excesso de androgenos durante estagios criticos da diferenciacao sexual leva a virilizacao da genitalia externa de fetos 46,XX resultando em uma genitalia ambigua ao nascimento, a pseudopuberdade precoce em ambos os sexos e a crises de perda de sal quando a atividade residual enzimatica e menor que 1%. Sinais de excesso de androgeno na forma nao classica podem ser acne, hirsutismo e desordens menstruais em mulheres jovens, contudo podem se manifestar anteriormente no desenvolvimento como: puberdade precoce, crescimento linear acelerado e maturacao ossea avancada. Todavia, e bem conhecido que alguns individuos com HAC nao classica podem permanecer assintomaticos. Os objetivos deste projeto foram analisar o papel funcional de dez novas mutacoes (p.Leu12Met; p.Arg16Cys; p.Ser101Asn; p.Ser202Gly; p.Pro267Leu; p.Val358Ile; p.Arg369Gln; p.Asp377Tyr; p.Thr450Met; e p.Leu461Pro), uma nova delecao in frame (p.Gln398_Ala391del), duas mutacoes que foram descritas anteriormente, entretanto sem estudos funcionais (p.Ser113Phe e p.Thr450Pro) e tres combinacoes de mutacoes in cis (p.Ile172Asn+p.Val358Ile; p.Val281Leu+p.Arg369Gln; e p.Asp377Tyr+p.Leu461Pro); e estabelecer uma correlacao genotipo-fenotipo para as mutacoes investigadas in vitro. Alem dos metodos classicos para os estudos moleculares, a metodologia deste estudo incluiu a expressao das proteinas CYP21A2 normal e mutantes para os ensaios de determinacao da atividade enzimatica e da cinetica enzimatica, bem como a verificacao da expressao proteica por Western blot. Estudos in vitro demostraram que uma mutacao e uma variante normal do gene CYP21A2 (p.Leu12Met) apresentando atividade residual proxima de 100%, nove (p.Arg16Cys; p.Ser101Asn; p.Ser202Gly; p.Pro267Leu; p.Val358Ile; p.Arg369Gln; p.Asp377Tyr; p.Thr450Met; e p.Leu461Pro) se associam a forma nao classica leve de HAC com atividades residuais entre 35% e 95% e, tres (p.Ser113Phe, p.Gln398_Ala391del e p.Thr450Pro) resultam em HAC forma classica com atividades residuais abaixo de 4%. As tres combinacoes de mutacoes in cis apresentaram efeito sinergistico na atividade residual enzimatica. Este estudo permitiu uma correta correlacao genotipo-fenotipo. Abstract