Strukturelle und funktionelle Untersuchungen des Transducers HtrII aus Natronomonas pharaonis und von HtrII/Tar-Chimären

Das halophile Archaebakterium Natronomonas pharaonis besitzt die Fahigkeit zur Phototaxis. Das Lichtsignal wird von dem sensorischen Rhodopsin NpSRII wahrgenommen und auf den Photo-Transducer NpHtrII ubertragen, wodurch es zu einer photophoben Antwort auf blaues Licht kommt. Der NpHtrII wurde erfolgreich heterolog im Bakterium E. coli mit einer Ausbeute von ca. 0,6 – 0,9 mg/L Zellkultur exprimiert und nachfolgend mit biochemischen und biophysikalischen Methoden charakterisiert. Durch ITC- und Photozyklus Messungen konnte eine Bindung des sensorischen Rezeptors NpSRII an NpHtrII nachgewiesen werden. CD- und FTIR Messungen zeigen dabei einen hohen alpha-helikalen Sekundarstruktur-Anteil. Untersuchungen durch Grosenausschluss-Chromatographie lieferten Hinweise auf eine Oligomerisierung der Transducer-Molekule. Mittels ortsspezifischer Spinmarkierung und ESR-Spektroskopie konnte eine coiled-coil bzw. eine 4-Helix-Bundel Struktur fur den Interaktionsbereich des Transducers mit der nachgeschalteten Histidin-Kinase CheA bestatigt werden. Zudem liesen sich erste Hinweise auf reizinduzierte Anderungen der Protein-Dynamik in der Signaldomane beobachten, wodurch erste Hinweise auf den Mechanismus der intra- und intermolekularen Signalweiterleitung durch Konformationsanderungen erhalten wurden. Auf Grundlage der grosen Homologie zwischen der archaebakteriellen Phototaxis und der eubakteriellen Chemotaxis wurden im Weiteren Chimaren entwickelt, die aus dem N-terminalen Bereich des NpHtrII fusioniert mit dem C-terminalen Bereich des Tar-Rezeptors aus E. coli bestehen. Eine Charakterisierung dieser Fusionsproteine wurde ebenfalls mit Hilfe von ESR-Messungen und Funktionalitatsuntersuchungen durchgefuhrt. Zu letzteren gehorten ein in vitro Phosphorylierungs-Assay und ein in vivo Schwimmversuch zur Etablierung eines Modellsystems der Phototaxis im Bakterium E. coli.