Mecanismos ionicos envolvidos na regulação da secreção de insulina por agonistas muscarinicos

O presente trabalho teve como proposta caracterizar o subtipo funcional de mAChR na celula ? pancreatica, bem como elucidar os mecanismos ionicos envolvidos na estimulacao muscarinica. Para isto, foram utilizadas ilhotas de ratos e camundongos, isoladas por digestao enzimatica ou microdisseccao. A resposta celular frente a estimulacao pelo agonista muscarinico OXO-M foi analisada sob diferentes aspectos: (1) secrecao de insulina; (2) efluxo de radioisotopos (45Ca e 86Rb); (3) concentracao citoplasmatica de Ca2+ ([Ca2+]i); (4) atividade eletrica; e (5) expressao dos mAChRs. Os resultados mostram que OXO-M aumentou, de forma dose-dependente, a secrecao de insulina por ilhotas de roedores. Na presenca de alta concentracao (50 µM), OXO-M induziu uma resposta bifasica da secrecao, tanto na presenca de 5,6 quanto de 16,7 mM de glicose. O aumento da secrecao induzido pela OXO-M foi drasticamente reduzido pela retirada de Ca2+ do meio perfusor, e completamente abolido na ausencia de glicose. Entretanto, na ausencia de glicose mas na presenca de K+ em concentracao despolarizante (40 mM), OXO-M aumentou significativamente a secrecao de insulina. O efeito potencializador da OXO-M foi inibido pelos antagonistas 4-DAMP (M3); p-F-HHSiD (M3>M1>M2) e pirenzepina (M1) com valores de IC50 para estes antagonistas de ~ 5, 20 e 340 nM, respectivamente. A analise molecular do subtipo de mAChR expresso nas ilhotas pancreaticas, realizada pela amplificacao do cDNA por PCR, demonstrou a presenca dos subtipos M1 e M3 no tecido. Entretanto, o estudo farmacologico indicou que o subtipo M3 representa o receptor muscarinico que medeia a estimulacao da celula ?. Em outra serie de experimentos, foram estudados os movimentos ionicos envolvidos na estimulacao celular induzida pela OXO-M. Na presenca de 5,6, 11,2 ou na ausencia de glicose, OXO-M aumentou a [Ca2+]i de celulas ? isoladas. Este aumento foi parcialmente inibido pela adicao de EGT A no meio de perfusao. OXO-M (50 µM) tambem aumentou o efluxo de 45Ca de ilhotas perfundidas, tanto na presenca quanto na ausencia de Ca2+ no meio extracelular. Entretanto, na ausencia de Ca2+ (condicao que representa o fluxo unidirecional provindo de compartimentos intracelulares), o aumento no efluxo foi transiente. A curva obtida pela diferenca entre os efluxos normalizados, em ambas as condicoes experimentais, demonstrou a presenca de um segundo componente, de aparecimento tardio e provavelmente decorrente da entrada de Ca2+ nas celulas. Tanto na presenca quanto na ausencia de glicose, OXO-M aumentou o efluxo do 86Rb. OXO-M tambem aumentou a atividade eletrica induzida pela glicose. Em 11,2 mM de glicose, OXO-M (0,1 e 10 µM) produziu diferentes efeitos sobre a atividade eletrica. Em ambas as concentracoes, o agonista provocou o aumento na frequencia de bursts. Por outro lado, em presenca de concentracoes micromolares OXO-M induziu alteracoes multifasicas na atividade eletrica, caracterizada pela inibicao transiente da atividade eletrica (i.e., polarizacao da membrana), seguida pelo aumento na frequencia de bursts e por uma pequena despolarizacao da membrana na fase silente. O efeito polarizante da OXO-M foi inibido pela ChTX, um bloqueador dos canais de K+ ativados por Ca2+ (KCa). A permeabilidade ao K+, calculada a partir dos valores de efluxo do 86Rb e de potencial de membrana, aumentou durante a fase de polarizacao, mas nao foi diferente do controle durante o estado estacionario. Concluindo, o efeito potencializador da OXO-M sobre a secrecao de insulina induzida pela glicose depende da ativacao dos receptores muscarinicos do subtipo M3, presentes na membrana da celula ?. Semelhante ao observado na estimulacao por outros agonistas (p.e., ACh e CCh), o aumento na secrecao depende da presenca de glicose e Ca2+ no meio extracelular. A polarizacao transiente induzida por concentracoes micromolares de OXO-M representa a ativacao dos canais KCa. Por outro lado, a permeabilidade ao K+ no periodo estacionario indica que a despolarizacao da membrana nao e consequencia do bloqueio de canais de K+, mas provavelmente da ativacao de uma corrente sensivel aos niveis intracelulares de Ca2+ (CRAC). Assim, o balanco entre a ativacao dos canais KCa e CRAC poderiam determinar o grau de despolarizacao induzi da por agonistas muscarinicos, mecanismo este provavelmente importante na modulacao da secrecao de insulina durante a estimulacao colinergica Ab