Développement de nouvelles méthodes de microscopie et d’électrochimie pour des analyses multi-paramétriques de mitochondries individuelles cardiaques

L’importance de la mitochondrie dans la gestion de l’energie cellulaire, d’un point de vue physiologique (contraction cardiaque, etc) ou pathologique (cancer, Alzheimer, etc) n’est plus a demontrer. Dans le contexte de la contraction cardiaque, qui est un processus fortement ATP-dependant, l’intervention exacte de la mitochondrie reste aujourd’hui sujet a debat. Une hypothese avance que la mitochondrie ne voit qu’un faible pourcentage (1%) du flux calcique necessaire a la contraction, une autre hypothese propose que la mitochondrie, qui produit 90% de l’ATP cellulaire, est activee par ce flux calcique a chaque contraction pour repondre a la demande energetique. Un element de reponse pourrait etre l’ouverture du pore de transition de permeabilite mitochondrial (mPTP), qui est principalement active par le calcium. Si ce pore non specifique est principalement connu pour son ouverture pathologique, notamment dans l’ischemie-reperfusion en declenchant l’apoptose, c’est son mode d’ouverture physiologique qui serait important dans ce contexte cardiaque en jouant un role crucial dans la gestion des flux calciques mitochondriaux. Cependant, ce mode d’ouverture est encore peu caracterise, notamment car les techniques utilisees reposent bien souvent sur le suivi moyen de large population mitochondriales, or de plus en plus d’etudes montrent l’existence de sous populations mitochondriales au sein d’une meme cellule, presentant des differences d’activites entre elles. L’objectif de cette etude etait de developper des nouvelles methodes d’analyse, afin de pouvoir suivre les variations d’activites des populations mais surtout, de pouvoir analyser les mitochondries individuellement. En utilisant ces methodes, des etudes des ouvertures physio-pathologiques du mPTP dans le contexte de contraction cardiaque peuvent etre menees.La premiere approche que j’ai developpee est basee sur la microscopie optique, elle se compose de trois grandes etapes : 1) traitement des images de microscopie, 2) identification des mitochondries et leur suivi dans le temps, 3) analyses informatiques. La deuxieme approche a ete basee sur l’electrochimie, elle repose sur une detection simultanee de la consommation d’oxygene mitochondriale et du taux de reduction des quinones de la chaine respiratoire. Pour caracteriser ces methodes, nous avons dans un premier temps suivi les etats bioenergetiques mitochondriaux classiques. Nous avons ainsi montre une grande variete de reponses avec l’observation de deux sous-populations mitochondriales de tailles distinctes. Puis, dans un deuxieme temps nous avons utilise la microscopie de fluorescence pour suivre sur mitochondrie unique, des variations transitoires du potentiel de membrane que l’on relie aux ouvertures du mPTP. Nous avons ainsi confirme que l’activation du mode d’ouverture pathologique peut etre induit par un front de concentration de calcium, et est inhibe par la cyclosporine A (CsA). Surtout, nous avons observe des ouvertures transitoires du mPTP, active egalement par le calcium mais egalement par la photo-illumination, en revanche dans notre etude ce mode d’ouverture n’est pas inhibe par la CsA ce qui suggere d’un mecanisme different.