Cinética del enlazamiento de H33342 a la p-glicoproteína: detección y análisis de curvas de progreso

El transportador multidrogas P-glicoproteina (Pgp) lleva a cabo el eflujo celular, ATP-dependiente, de muchas drogas hidrofobicas, productos naturales y peptidos. Se propone que la Pgp contiene dos sitios de transporte, conocidos como los sitios -H y -R por sus preferencias por Hoechst 33342 (H33342) y rodamina 123, respectivamente. Cuando H33342 interactua con la Pgp purificada, su rendimiento cuantico incrementa debido al ambiente hidrofobico del bolsillo de enlazamiento –H. En este trabajo, estudiamos el enlazamiento de H33342 a la Pgp empleando experimentos cineticos en la modalidad de stoppedflow. El curso temporal de la reaccion fue seguido por el incremento de la fluorescencia del colorante y analizado con la herramienta computacional DYNAFIT, usando un modelo donde una reaccion bimolecular rapida, es seguida por tres isomerizaciones secuenciales. Adicionalmente, bajo condiciones de seudo-primer-orden (exceso del ligando), la reaccion presento cuatro relajaciones caracterizadas por cuatro constantes de tiempo (Ai`s) y cuatro amplitudes (Ai`s) Estos parametros fueron analizados utilizando la tecnica de la matriz de los operadores de proyeccion. Esta aproximacion aporto, por primera vez, informacion acerca de las constantes de velocidad y propiedades fluorescentes de los diversos intermediarios formados durante el enlazamiento de H33342 a la Pgp. The P-glycoprotein multidrug transporter (Pgp) carries out ATP-driven cellular efflux of many different hydrophobic drugs, natural products, and peptides. Pgp is proposed to contain two drug transport sites, known as the H site and the R site for their preference for Hoechst 33342 (H33342) and rhodamine 123, respectively. When H33342 interacts with purified Pgp, its quantum yield is increased due to transfer to a hydrophobic environment within the H binding pocket, as shown by the steady-state fluorescence emission. In this work, we studied the binding of H33342 to Pgp using stopped-flow kinetic experiments. The time course of the reaction was followed by enhancement of dye fluorescence and analyzed by the computational tool DYNAFIT, using the model of a fast bimolecular reaction, followed by a three-step sequential isomerization. Additionally, under pseudo-first-order conditions (excess ligand), the reaction presented five normal modes, characterized by four relaxation times (Ai`s) and four amplitudes (Ai`s) These parameters were analyzed using the matrix projection operator technique, considering a four-step sequential reaction. This approach provides, for the first time, information about the rate constants and fluorescent properties of the diverse intermediates formed during the binding of H33342 to Pgp.