Un abordaje de la reconstrucción auricular desde la ingeniería tisular

lntroduccion: La reconstruccion de defectos auriculares, ya sean congenitos o adquiridos, supone un reto para la cirugia reconstructiva. Los metodos disponibles actualmente se resumen en reconstrucciones mediante cartilago autologo, materiales sinteticos o protesis externas. De ellos, Ia reconstruccion mediante cartilago costal constituye el gold standard actual.Sin embargo, no esta exento de riesgos y complicaciones, entre los que estan las extrusion del implante, la deformidad y el dolor residual de la zona donante, y la perforacion pleural.Para superar las limitaciones de tejido donante (cartilago autologo) y reducir la morbilidad asociada con su obtencion, los metodos de ingenieria Tisular se postulan como una opcion reconstructiva atractiva. Mediante este trabajo se pretende valorar la utilidad de un nuevo soporte desarrollado por el Centro Comunitario de Sangre y Tejidos a partir de proteinas plasmaticas en estrategias de ingenieria Tisular de cartilago para su posterior aplicacion clinica en reconstruccion de defectos auriculares. Objetivos: 1. Medir las caracteristicas estructurales y biocineticas del soporte desarrollado a partir de proteinas plasmaticas. 2. Evaluar el comportamiento de cultivos de condrocitos auriculares sembrados sobre los soportes antes mencionados, con respecto a la capacidad de rediferenciacion y produccion de cartilago in vitro. 3. Evaluar el comportamiento de cultivos de condrocitos auriculares sembrados sobre soportes e implantados como injertos libres de forma heterotopica en el dorso de animales inmunodeficientes, con respecto a la capacidad de produccion de cartilago. 4. Evaluar la capacidad del injerto antes mencionado utilizado de forma autologa para reparar defectos auriculares. Material y metodos: El trabajo se organizo en cuatro subestudios: Subestudio l: Se produjeron soportes celulares a partir de sangre venosa de banco, mediante su desnaturalizacion por la adicion de glutaraldehido y la posterior liofilizacion de la mezcla. Algunos soportes fueron analizados mediante microscopia electronica de barrido para describir su microestructura. Otros fueron evaluados mediante un biorreometro para medir su comportamiento ante la compresion. Por ultimo, varios fueron implantados subcutaneamente en el dorso de un conejo de Nueva Zelanda. Posteriormente fueron extraidos periodicamente, pesados, fotografiados e incluidos para examen histologico para averiguar su velocidad de degradacion. Subestudio ll:Se obtuvieron condrocitos a partir de biopsias de cartilago auricular de conejos de Nueva Zelanda. Estos condrocitos fueron expandidos en monocapa, sembrados sobre soportes proteicos y cultivados en medio condrogenico para su rediferenciacion durante tres meses. Transcurrido esa tiempo, se tomaron muestras para examen histologico y mediante microscopia electronica de barrido. Subestudio lll: Se sembraron cultivos de condrocitos rediferenciados sobre soportes celulares, y estos constructos se implantaron subcutaneamente en el dorso de un raton atimico. Dos meses despues, se sacrifico el animal y se extrajeron los implantes para su examen histologico. Subestudio lV: Se efectuaron defectos circulares de espesor completo en las orejas de 5 conejos de Nueva Zelanda. En algunos de esos defectos se introdujeron soportes sin celulas, en otros se introdujeron soportes sembrados con condrocitos autologos expandidos y rediferenciados in vitro. Uno de esos cultivos se habia marcado previamente con un retrovirus productor de Proteina Verde Fluorescente (GFP). Cuatro meses despues, los animales fueron sacrificados y los sitios de implante fueron extraidos en bloque para su posterior estudio histologico e inmunohistoquimico. Resultados: Subestudio l. El analisis de las imagenes de microscopia electronica de barrido mostraban una estructura espongiforme con un tamano de poro entre 150 y 300 µm y una casi completa interconectividad. La grafica obtenida con el biorreometro muestra un comportamiento del soporte mas elastico que viscoso, con una ocritica de 22 Pa. Se elaboro una grafica con los pesos de los explantes de los soportes acelulares, mostrando una vida media de aproximadamente dos meses y una desaparicion macroscopica del soporte a los cuatro meses de evolucion. Subestudio ll. Se constato la rediferenciacion morfologica de los condrocitos tras tres meses en medio de rediferenciacion condrogenico. Sin embargo, no se observo produccion de matriz extracelular. Subestudio lll: A los dos meses del implante subcutaneo, se observo cartilago maduro entre los poros del soporte. Este cartilago mostraba positividad en su matriz extracelular para colageno tipo ll y glicosaminglicanos, pero no para elastina. Subestudio lV: El estudio de los sitios de implante de soportes acelulares mostro el relleno del defecto por tejido conectivo. Sin embargo, los sitios de implante de soportes con condrocitos aparecian rellenos por un material blanco y duro. El examen histologico de dicho material demostro la presencia de tejido cartilaginoso maduro junto con areas de diferenciacion osea. En las muestras marcadas con GFP, aparecian marcadas las celulas del cartilago y las que estaban en las zonas de diferenciacion osea. Discusion: Frente a los metodos actuales de reconstruccion auricular, la ingenieria Tisular surge como una opcion deseable por Ia capacidad de producir cartilago a costa de una morbilidad minima. Para ello, aun no se ha encontrado un soporte celular ideal. El soporte desarrollado por el Centro Comunitario cumple muchas de las propiedades ideales para la produccion de cartilago, siendo facil de elaborar, teniendo una microestructura favorable y siendo posible su utilizacion autologa. Utilizando la metodologia de este trabajo, no se ha conseguido producir cartilago in vitro. Sin embargo la utilizacion de soportes sembrados con condrocitos como injertos libres en el dorso de conejos de Nueva Zelanda consigue producir tejido cartilaginoso maduro. La aplicacion de estos injertos en defectos experimentales auriculares consigue su reparacion con cartilago, observandose areas de osificacion asociadas a restos de soporte. El origen de esta osificacion es desconocido, y puede limitar su aplicacion clinica. Sin embargo una estrategia en dos tiempos, con un implante inicial en subcutaneo y un transplante eutopico posterior, puede evitar esa formacion ectopica de hueso. Conclusiones: -El soporte desarrollado por el CCST y utilizado presenta caracteristicas fisicas y biocineticas que lo hacen util en estrategias de ingenieria Tisular de cartilago. -El soporte utilizado permite el cultivo y la rediferenciacion do condrocitos in vitro, pero con el metodo utilizado no es posible producir cartilago in vitro. -Es posible producir cartilago in vivo de forma ectopica (tejido subcutaneo) mediante el uso de soportes sembrados con condrocitos. -Es posible reparar defectos experimentales en orejas utilizando soportes sembrados con condrocitos autologos. Sin embargo, la produccion ectopica de hueso, de etiologia desconocida, limite el uso clinico de esta tecnologia.