Immunological studies on Swine Influenza Virus in pigs: from gene to epitopes

El virus de la gripe porcina (VGP) es un patogeno importante en el sector veterinario con un gran potencial zoonotico, y por lo tanto se considera tambien una amenaza potencial para la salud publica. La vigilancia y el control de este patogeno en cerdos es por lo tanto crucial. Los metodos actuales de control se basan en la profilaxis, en particular, en vacunas que suscitan una respuesta de tipo humoral. La capacidad de escape y la alta variabilidad de VGP hacen que la eficacia de estas vacunas pueda verse comprometida; por tanto, deben ser actualizadas periodicamente. El mismo problema se plantea en la salud humana donde se estan desarrollando vacunas disenadas racionalmente con tal de solventarlo. Estas vacunas estan siendo disenadas para potenciar la respuesta de celulas T contra el virus de la gripe A (VGA). La respuesta de celulas T esta relacionada con la proteccion contra la infeccion por el VGA, centrandose en las proteinas internas y altamente conservadas del virus. Esto permitiria resolver los problemas anteriormente citados. Los epitopos de celulas T de VGP conocidos en cerdos son solo unos pocos y estan relacionados con el Complejo Mayor de Histocompatibilidad porcino de clase I (CMHpo-I). La vacunologia inversa se utiliza en sanidad humana para identificar los epitopos de celulas T; sin embargo, en cerdos este concepto se ha sido introducido recientemente y por lo tanto se dispone de pocas herramientas. El objetivo principal de este trabajo era identificar epitopos de celulas T para disenar racionalmente vacunas contra VGP. Para este proposito, se abordaron las siguientes estrategias. La vigilancia de VGP es fundamental para un control adecuado. La situacion epidemiologica de VGP en Espana debia ser actualizada y se necesitaban mas datos geneticos para permitir el uso de la vacunologia inversa. El estudio realizado mostro que la situacion epidemiologica de Espana era similar a la de otros paises europeos; las cepas circulantes estaban estrechamente relacionadas y evolucionaron de la misma manera. Sin embargo, tambien se encontraron exepciones; una cepa evoluciono de forma divergente en Espana. Se sugiere que el cambio genetico pueda ser un evento reciente en la evolucion de esas cepas. Los ensayos in vitro para determinar la afinidad de union de epitopos a CMHpo-I disponibles actualmente son pocos y estan basados en moleculas recombinantes. Por lo tanto, en primera instancia se intento generar una herramienta in vitro basada en la forma nativa del CMHpo-I. Para ello se diseno y desarrollo casi por completo un ensayo de reconstitucion de MHC aplicado a CMHpo-I, para el cual se generaron celulas C1R que expresaran el alelo SLA-1*es11 de los cerdos singenicos Babraham. Por ultimo se puso a punto el ensayo de desnaturalizacion. A continuacion, se aplico la vacunologia inversa para identificar epitopos de celulas T. Se predijeron epitopos del VGP in silico mediante NetMHCpan para los alelos CMHpo-I de los cerdos singenicos Babraham (SLA-1*es11 y SLA-2*es22); estos epitopos se probaron mediante ensayos funcionales ex vivo (IFN? y respuesta de proliferacion) usando celulas de cerdos Babraham inmunizados. Desafortunadamente, este enfoque no dio ningun epitopo positivo. Los epitopos de celulas T fueron tambien identificados empiricamente. Las proteinas M1 y NP de un VGA humano fueron seleccionadas como diana, se estudiaron mediante el uso de peptidos solapantes y metodos funcionales (IFN? y respuestas de proliferacion) hasta encontrar epitopos de celulas T. Los epitopos fueron analizados con celulas procedentes de cerdos Babraham inmunizados con VGA. Se encontraron dos epitopos CMHpo de clase II solapados, NP405-416 y NP407-420. En otro intento, se utilizo una estrategia mas compleja de vacunologia inversa. Esta habia sido utilizada anteriormente por otros autores y comprende una combinacion de metodos: prediccion de epitopos in silico mediante NetMHCpan y validacion de los resultados utilizando las preferencias de union del alelo CMHpo determinadas in vitro, analisis in vitro mediante un ensayo de union y analisis in vivo mediante tetrameros. Los peptidos fueron identificados en animales infectados y expuestos a dos VGP heterologos. Esta estrategia demostro ser muy precisa y asi se identifico un epitopo inmunodominante (NA171-180). En general, estos datos allanan el camino para el diseno racional de una vacuna contra la SwIV a parte de proporcionar una nueva vision de la respuesta de los cerdos a la infeccion o inmunizacion con VGA.