融合基因anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3（ζ）的构建及真核表达

本研究利用SWISS-MODEL预测该融合蛋白的三级结构。利用PCR的方法分别从重组pPIC9k、重组pBullet和pSecTag2B上扩增出3段基因片段,即片段anti-erbB2 scFv（简称A）、片段Fc-CD28-CD3（ζ）（简称B）和信号肽序列（简称S）。利用SOE-PCR将3段序列连接形成融合基因片段S-A-B。经TA克隆扩增及鉴定后,将融合基因片段与逆转录病毒表达载体pLNCX相连构建重组真核表达载体,电转染人淋巴瘤T细胞株Jurkat,G418筛选后用流式细胞术检测融合蛋白稳定表达情况。经预测在anti-erbB2 scFv与Fc基因片段之间不加连接肽的融合蛋白,在三级结构上可形成更佳的功能构象。经PCR、酶切及测序鉴定均证实成功构建重组真核表达载体pLNCX/S-A-B（在A与B基因片段之间不加linker）。经流式细胞术检测,在转染的Jurkat细胞中融合蛋白表达率约为56.17%。本研究应用分子克隆的方法成功地构建了重组真核表达载体pLNCX/anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3（ζ）,融合基因能够在淋巴瘤T细胞株中表达,为制备含该融合基因的原代T淋巴细胞,进行erbB2过表达肿瘤的靶向基因治疗研究奠定了实验基础。