Klonierung, Expression und Charakterisierung der Metalloproteinase-Domäne und Disintegrin-Domäne von humanem ADAM 15

Durch Isolierung der Gesamt-RNA aus den beiden humanen Ovarialkarzinomzelllinien OV-MZ-6 und OVCAR-3 und der humanen Mammakarzinomzelllinie MDA-MB-231 konnte mittels RT-PCR und Verwendung spezifischer Primer die fur humanes ADAM 15 kodierende full length-DNA synthetisiert werden. Die anschliesende DNA-Sequenzierung belegte erstmals die konstitutive Expression von hADAM 15 in diesen drei Tumorzelltypen. Durch Verwendung der full length-cDNA als PCR-Templat gelang die Klonierung verschiedener hADAM 15-cDNA-Fragmente, die nach Ligation in Expressionsvektoren, zur Transformation bzw. Transfektion von E. coli und P. pastoris bzw. den beiden Saugerzellen OV-MZ-6 und CHO eingesetzt wurden. Nach Etablierung der entsprechenden heterologen Expressionssysteme war die proteinchemische und zellbiologische Charakterisierung der Funktion von hADAM 15 moglich. Hierzu wurde nach Reinigung der in E. coli exprimierten Metalloproteinase-Domane ein gegen diese Domane gerichteter polyklonaler Antikorper hergestellt. Nach Reinigung des Antikorpers konnte dieser zur Detektion rekombinanter hADAM 15-Fragmente in der Western-Blot- und Kolonie-Blot-Analyse eingesetzt werden. Der Antikorper ermoglichte Aussagen uber Expressionsraten, Prozessierung und Glykosylierung der rekombinaten hADAM 15-Fragmente. Die heterologe Expression potentiell proteolytisch aktiver und inaktiver Varianten von hADAM 15 in P. pastoris erbrachte erstmals Hinweise auf eine proteolytische Aktivitat des Enzyms. Nur bei heterologer Expression der Proform der potentiell aktiven Metalloproteinase-Domane von hADAM 15 wurde die Aktivitat einer konstitutiv exprimierten P. pastoris-Proteinase unterdruckt. Die Expression der entsprechend potentiell inaktiven Mutante der Proform der Metalloproteinase-Domane beeinflusste die Aktivitat dieser P. pastoris-Proteinase nicht. Zusatzlich zur Metalloproteinase-Domane wurde in dieser Arbeit die Disintegrin-Domane von hADAM 15 untersucht, die als einzige der bisher bekannten ADAMs ein RGD-Motiv enthalt. Hierbei interessierte insbesondere die integrinantagonistische Wirkung von hADAM 15 in der humanen Ovarialkarzinomzelllinie OV-MZ-6. Eine Uberexpression von hADAM 15 fuhrte in dieser Zelllinie zu einer signifikanten Unterdruckung der Adhasion auf Vitronektin. Diese antiadhasive Wirkung konnte auf eine Beteiligung von hADAM 15 bei der Disseminierung von Zellen in andere Gewebe hindeuten. Moglicherweise konnten die antiadhasiven Eigenschaften von hADAM 15 - in Analogie zu anderen RGD-Disintegrinen - auch zur Induktion apoptotischer Vorgange fuhren.