Sistemas nanoparticulares autoensamblados basados en ciclodextrinas para el transporte de fármacos y material génico

Las beta-ciclodextrinas (bCD) juegan un papel importante en el desarrollo de estructuras supramoleculares, a veces llevando a nuevas propiedades biofuncionales. En esta Tesis, la bCD se ha usado como plataforma modelo para la preparacion de estructuras bien definidas para la inhibicion de la toxina del antrax y transporte controlado de farmacos y genes. Metodologias de funcionalizacion eficientes tales como la formacion de 1,2,3-triazoles catalizada por Cu(I) (CuAAC) o el acoplamiento entre aminas e isotiocianatos se han usado para la generacion de diversidad molecular. Esta estrategia general ha demostrado ser util para acceder a series de macromoleculas monodispersas para estudios de estructura-actividad. - Inhibicion de la toxina de antrax. En la literatura se describe que preporos de la toxina de antrax pueden ser bloqueados por derivados policationicos de bCD simetricas, evitando la internalizacion de factores toxicos e inhibiendo en el rango micromolar la accion de la toxina. Una serie de clusteres clic construidos sobre la cara primaria de la bCD se prepararon mediante la reaccion CuAAC, lo que permitio controlar parametros tales como la densidad de carga cationica o la longitud del espaciado entre el nucleo de la bCD y el cluster. En los resultados de inhibicion en RAW 264.7 no se observo actividad en contraposicion a analogos basados en tioureas, posiblemente debido a restricciones conformacionales que evitan la interaccion entre el preporo y el cluster. No obstante, se demostro que la CuAAC esta bien adaptada a la generacion de diversidad molecular de manera eficiente. - Transporte de farmacos. Aunque las bCDs han sido usadas ampliamente en transporte de farmacos para mejorar las caracteristicas de la formulacion, un problema asociado es la baja capacidad de carga. Derivados per(O-2,O-3)-hexanoil bCD neutras son capaces de autoorganizarse en agua mediante nanoprecipitacion para dar nanoparticulas poco polidispersas, capaces de encapsular farmacos con altas cargas y liberarlos de manera gradual. Para mejorar las caracteristicas de las nanoparticulas basadas en bCDs como sistemas de transporte de farmacos, hemos desarrollado una serie de conjugados de bCD dimericas con capacidad de autoorganizacion, constituidas por una unidad hidrofoba y una unidad hidrofila, separadas mediante un espaciador de longitud definida. Las nanoesferas resultantes fueron caracterizadas por dispersion dinamica de laser y medidas de potencial zeta, mostrando ademas capacidad de encapsular Diazepam (~76 % de eficiencia) y liberarlo de manera controlada. Las propiedades mejoradas de complejacion supramolecular de las nanoesferas se usaron para la funcionalizacion via supramolecular con conjugados de adamantilmanopiranosidos, dotando a las nanoparticulas de capacidad de reconocimiento por lectinas. Esto fue confirmado mediante la realizacion de ensayos ELLA. - Transporte de genes. La funcionalizacion de dominios hidrofilos y lipofilos en el nucleo de la bCD permite el acceso a derivados que se comportan como sistemas eficientes de transporte de genes. Una primera generacion de CD policationicas anfifilicas (paCDs) se prepararon mediante CuAAC, ajustando la densidad cationica, flexibilidad del cluster o el balance hidrofilo-lipofilo. Estos vectores mostraron capacidad de complejar y proteger ADN tras la formacion de complejos (CDplejos) , asi como promover la transfeccion en celulas CHO-k1 con eficiencias similares a las de la LipofectaminaTM2000. Una segunda generacion se sintetizo mediante la combinacion de la CuAAC usando catalizadores heterogeneos para facilitar las condiciones de preparacion, con la reaccion de formacion de tioureas, demostrandose que la combinacion de ambas estrategias es adecuada para la generacion de diversidad molecular. Los resultados indican que estas reacciones secuenciales representan una estrategia versatil para optimizar las propiedades de transporte de genes basadas en paCDs. La incorporacion de segmentos lineales de oligoetilenimina mediante las metodologias descritas anteriormente permitio la preparacion de sistemas eficientes de transporte de genes, siendo tambien adecuadas para el transporte de pequenos ARN interferentes en celulas U-87. Los ensayos MTT indicaron ausencia de toxicidad. Las propiedades de autoorganizacion de paCDs basadas en tioureas o triazoles en ausencia y presencia de ADN tambien se han estudiado, esencialmente mediante tecnicas de dispersion de luz y microscopia. Los resultados sugieren que las paCDs pueden comportarse como cristales liquidos. Ademas, se evaluo la capacidad terapeutica de los vectores de genes in vivo. Tras una criba previa en funcion de la eficiencia de transfeccion en lineas celulares humanas (HeLa, HepG2) a altas concentraciones de suero (60%) se selecciono un candidato que se uso para promover la transfeccion in vitro de un plasmido que codifica una proteina terapeutica, la interleuquina 12. Ensayos de transporte de genes in vivo por inyeccion sistemica en ratones mostraron niveles relativamente altos de transfeccion en higado de genes reporteros. Para promover el transporte dirigido de genes se prepararon y evaluaron una serie de CDs policationicas glicoanfifilicas (pGaCDs) que se encuentran funcionalizadas con ligandos de manosa biorreconocibles. Ensayos ELLA mostraron una alta afinidad de los correspondientes glicoCDplejos por concanavalina A asi como por un receptor de manosa de macrofagos humanos recombinante. La evaluacion de de la habilidad de adhesion de las CDplejos manosilados confirmaron los resultados obtenidos por ELLA. Por otra parte, la transfeccion mediada por receptor se estudio en RAW264.7 en presencia de un ligando competidor asi como por experimentos FACS. Para investigar la influencia de las distintas proporciones de ligando de manosa en la superficie del nanocomplejo, una serie de pGaCDs estadisticas han sido preparadas. Los experimentos de transfeccion mostraron un incremento gradual de la eficiencia, que fue mas marcada en el caso de celulas RAW264.7. Finalmente, una nueva familia de prototipos de vectores de genes macromoleculares ha sido propuesta, consistente en paCDs dimericas altamente preorganizadas. Para ello, el paso clave es la monorreduccion de la per(O-2, O-3)-alquil-per-(C-6)-azido bCD a la monoamina correspondiente. Tras formacion del dimero se llevo a cabo la CuAAC sobre 12 grupos azido y obtencion de los hidrocloruros correspondientes. Los resultados preliminares indican propiedades de transporte de genes mejoradas en los sistemas dimericos, posiblemente debido a una mayor estabilidad de los CDplejos resultantes.