Validierung von durch Next Generation Sequencing ermittelten Mutationen im Androgenrezeptor-Gen und in potenziellen Co-Faktoren des Androgenrezeptors sowie exemplarische funktionelle Betrachtungen

Das Androgeninsensitivitatssyndrom (AIS) stellt eine der haufigsten Diagnosen, die eine Storung der Geschlechtsentwicklung mit mannlichem Genotyp (46,XY-DSD) verursachen, dar. Die Phanotypen sind extrem variabel, sodass Subgruppen charakterisiert werden. Dabei zeigt sich ein Patient mit einer kompletten Androgenresistenz (CAIS) als phanotypisch weiblich, wohingegen ein Patient mit einer partiellen Androgenresistenz (PAIS) mit einem ambivalenten Genitale imponiert. Die milde Androgenresistenz (MAIS) kann durch eine vorhandene Infertilitat auffallen. Eine Mutation im Gen des Androgenrezeptors (AR) bildet fur ein CAIS die haufigste Ursache, dagegen deutlich seltener fur ein PAIS. Die molekulargenetische Untersuchung ist daher bei Bestehen eines Verdachtes auf ein AIS unverzichtbar. Gegenuber alteren bewahrten Methoden, wie der Sanger-Sequenzierung, ist Next Generation Sequencing (NGS) als Hochdurchsatzverfahren in der Genomanalyse in Bezug auf Zeitersparnis und Kosteneffizienz besonders vorteilhaft, um eine grose Menge an Genen parallel zu untersuchen. Dadurch konnen im Zuge der AIS-Diagnostik nicht nur das AR-Gen, sondern auch weitere Gene, die mit der Krankheitsentstehung in Verbindung gebracht werden konnten, zeitgleich untersucht werden. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgefuhrte Validierung der NGS-Ergebnisse von AIS-Patienten mittels der Sanger-Sequenzierung war in allen Fallen erfolg¬reich. Dieses Ergebnis bestarkt NGS als Hochdurchsatzverfahren in seiner Genauigkeit hinsichtlich der Mutationsanalyse fur das AR-Gen und damit in der Anwendbarkeit in der AIS-Diagnostik. Somit leistet diese Arbeit einen Beitrag auf dem Weg zur Etablierung von NGS in der klinischen Anwendung im Rahmen der DSD-Diagnostik. Durch NGS konnten bei einigen Patienten, bei denen ein Verdacht auf ein AIS ohne eine Mutation im AR-Gen vorlag, weitere Mutationen in anderen Genen entdeckt werden. Diese Mutationen betreffen Gene, deren Funktionen mit dem AR oder mit der Synthese und Wirkung von Androgenen in der Literatur assoziiert wird. Dabei gab ein untersuchter Fall Anlass fur weitere Untersuchungen, da ohne AR-Gen-Mutation, aber mit einer Mutation im Gen von 17-beta-Hydroxysteroid-Dehydrogenase 3, ein pathologischer ApoD-Assay, der auf eine funktionelle Androgenresistenz der Fibroblasten hinweist, auffiel. Im Rahmen der Diagnostik wurde mittels NGS eine Mutation im KPNA1-Gen gefunden. Dieses Protein ist u. a. direkt am Import von nuklearen Rezeptoren, wie dem AR, in den Zellkern beteiligt. Die Experimente zur Untersuchung der nuklearen Translokation des AR wurden durch Immunfluoreszenz und Western Blot an kultivierten Genitalhaut¬fibroblasten und deren Proteinen durchgefuhrt. Dabei fielen Differenzen zu der mutierten Zelllinie von Patient 19 (Pat.19) auf. In der Immun¬fluoreszenz wiesen die Zellen von Pat.19 im Vergleich zu den Kontrollen eine verstarkte Signalanreicherung des AR im Nukleus auf. Des Weiteren zeigte sich im Western Bot eine erhohte Menge an AR-Protein in den Zellen von Pat.19 im Vergleich zu Kontrollen. Auch wurde eine grosere Menge an AR-Protein im Nukleus in den Zellen von Pat.19 im Vergleich zu Kontrollen nachgewiesen. Eine mogliche Begrundung fur die veranderte Lokalisation des AR in Zellen von Pat.19 im Vergleich zu Kontrollzelllinien konnte die heterozygote Mutation, die auf dem Chromosom 3 im KPNA1-Gen liegt, liefern. Damit beleuchtet diese Arbeit erstmalig eine KPNA1-Mutation vor dem Hintergrund einer funktionellen Androgenresistenz im Fibroblastenmodell und stellt einen Ausgangs¬punkt dar, den veranderten nuklearen Import des AR bei Pat.19 in weiteren Untersuchungen noch genauer zu charakteri¬sieren. Dadurch sollten weitere Informationen uber KPNA1 als potenziellen Co-Faktor des AR gewonnen werden, was moglicherweise einen Betrag leistet, AIS-Patienten ohne Mutation im AR-Gen, ein besseres Krankheitsverstandnis zu ermoglichen.