Estudio sobre el control del número de dedos de la extremidad de los tetrápodos

Introduccion En los vertebrados, el desarrollo de la extremidad comienza cuando las celulas mesodermicas indiferenciadas de la capa somatica del MPL se acumulan bajo el ectodermo de la pared lateral del cuerpo y la extremidad emerge como una pequena protuberancia, el esbozo de extremidad, formado por celulas mesodermicas recubiertas de una capa ectodermica. El posterior desarrollo de la extremidad depende de una serie de interacciones reciprocas entre el ectodermo y el mesodermo (E-M) que son cruciales para la morfogenesis del esbozo de extremidad. Este proceso implica la formacion de patron, conjunto de procesos en el que las celulas indiferenciadas reciben informacion posicional y son especificadas, determinadas y posteriormente diferenciadas para formar una estructura. Esta informacion posicional se realiza a traves de vias de senalizacion , mediadas por moleculas senalizadoras, que pueden ser agrupadas en cuatro grandes familias: la familia WNT, la familia de los FGFs, la familia HEDGEHOG y la superfamilia de los TGFs. La transduccion de senal por estos ligandos depende de una serie de factores de transcripcion, entre los que cabe destacar, por su importancia en el desarrollo de la extremidad, la familia de las proteinas GLI y la familia de las proteinas HOX. Estudios embriologicos clasicos e investigaciones a nivel molecular han permitido identificar varios centros senalizadores u organizadores de la extremidad en desarrollo, que regulan y coordinan el crecimiento y la formacion de patron del esbozo de extremidad a lo largo de tres ejes, el eje P-D, el eje A-P y el eje D-V. Tres son los centros senalizadores mas importantes. La cresta ectodermica apical (AER), un engrosamiento del ectodermo en la parte mas apical del esbozo de extremidad y que controla la formacion de patron en el eje P-D y cuya funcion esta mediada por varios miembros de la familia de los FGFs. La zona de actividad polarizadora (ZPA), localizada en el mesodermo posterior del esbozo de extremidad y con funcion senalizadora en el eje A-P, mediada por la proteina SHH. El ectodermo no- AER que controla la formacion de patron en el eje D-V y en cuya funcion son fundamentales las senalizaciones por WNT y BMPs, miembros estos ultimos de la superfamilia de los TGFs. El esbozo de extremidad crece y se alarga a lo largo del P-D. Primero las celulas mesodermicas se condensan y se diferencian a cartilago que, posteriormente es sustituido por hueso. Se van formando progresivamente tres segmentos el proximal o estilopodio, el intermedio o zeugopodio y el distal o autopodio que contiene los elementos esqueleticos de la mano/pie. Simultaneamente se va elaborando el patron en los otros dos ejes, A-P y D-V. Se conocen muchos de los genes que regulan el crecimiento y la formacion de patron en estos tres ejes, pero no esta claro como interactuan entre ellos. Los genes HOX son una familia altamente conservada de factores de transcripcion que controlan el desarrollo embrionario en todos los animales. Los mamiferos tienen 39 genes Hox organizados en cuatro clusters (HoxA, HoxB, HoxC y HoxD), cada uno conteniendo de 9 a 11 genes. Durante el desarrollo de la extremidad los clusters A y D desempenan papeles fundamentales en la formacion de patron a lo largo de los tres ejes, aunque se ha estudiado mas su papel en los ejes P-D y A-P. La especificacion de los tres segmentos P-D esta acompanada por un patron especifico de expresion de los genes 5'de los clusters A y D. Experimentos de perdida de funcion en raton han mostrado la existencia de una asociacion entre determinadas proteinas HOX y cada uno de los segmentos proximo distales. Por ejemplo, paralogos del grupo 11 y paralogos del grupo 13 son absolutamente necesarios para la formacion de patron del zeugopodio y autopodio respectivamente. Los fenotipos de ratones mutantes con perdida de funcion de alelos de los grupos 11, 12 y 13 pertenecientes a los cluster HOXA y HOXD, permite suponer que los 5'Hox estan implicados en el control del numero de dedos. Por otro lado, trabajos recientes, han puesto de manifiesto la conexion entre los genes Hox y las vias senalizadoras mas importantes para el desarrollo de la extremidad. Por ejemplo, se sabe que las proteinas HOX controlan la transcripcion de Shh y que se unen fisicamente a GLI3 (mediador de la actividad de SHH), y a SMADs (mediadores de la actividad de los BMPs) y modulan su actividad. Como senalamos anteriormente, el crecimiento y formacion de patron del esbozo de extremidad a lo largo de los ejes P-D y A-P esta controlado por la senalizacion de los FGFs de la AER y por SHH de la ZPA respectivamente. Un bucle de retroalimentacion positivo que se establece entre la AER-FGFs y ZPA-SHH es fundamental para este proceso y para el mantenimiento de los propios centros senalizadores. La perdida de alguna senal lleva a la downregulacion de la otras y tambien de los genes Hox y, como consecuencia, se para el desarrollo. Por otro lado, en ausencia de los clusters HOXA y HOXD, no se activa la transcripcion de Shh y AER-Fgfs estan downregulados, por lo que es dificil conocer la funcion individual de cada uno de ellos. Objetivos En esta tesis hemos tratado de profundizar en el conocimiento de la funcion de los genes Hox durante el desarrollo de la extremidad y, en particular, como estos factores de transcripcion interactuan con las principales moleculas senalizadoras asi como su papel en el control del numero de dedos en la extremidad de los tetrapodos. Resultados Para estudiar el papel de los genes 5'Hox en el crecimiento y formacion de patron del esbozo de extremidad, utilizamos el alelo mutante de Hoxa13 que interrumpe el Homeobox y por tanto conlleva perdida de funcion y la triple delecion de Hoxd11-13. Mediante cruces de dobles heterozigotos obtuvimos toda la serie alelica de dobles mutantes en los que por hibridacion in situ analizamos el patron de expresion de los componentes fundamentales de las vias de senalizacion que regulan el desarrollo de la extremidad. Nuestros resultados muestran que, en ausencia de Hoxa13 y Hoxd11-13, el dominio de expresion de Shh esta reducido. Ademas Fgf10 y Grem1 se encuentran restringidos al mesodermo posterior sin que se observe su normal expansion anterior. El bucle Shh-Grem1-Fgf4, se ve alterado sin que el dominio de Grem1 se separe de la ZPA a nivel posterior ni de la AER a nivel distal. De acuerdo con los modelos actualmente aceptados, la duracion del bucle se prolonga temporalmente en los dobles mutantes. Estos resultados indican indican la necesidad de los genes 5'Hox para la correcta terminacion del bucle y, por tanto, para el tamano final del esbozo de extremidad. Sin embargo, esta prolongacion en el tiempo no esta acompanada de un incremento del tamano, mas bien de una disminucion, poniendo de manifiesto la implicacion de los genes 5'Hox en la adecuada expansion del autopodio. Nuestros resultados ponen en evidencia que los genes Hox no solo actuarian upstream de las vias senalizadoras, puesto que son necesarios para el correcto establecimiento de las moleculas senalizadoras, si no tambien downstream de las mismas, probablemente interactuando con los mediadores intracelulares de las senales. Todo ello, sugiere la posibilidad de que, durante el desarrollo de la extremidad, las proteinas HOX puedan ser elementos fundamentales para la integracion de todas las senales reguladoras. El doble mutante Hoxa13 -/- ; HoxdDel(11-13)/Del(11-13) muere en mitad de la gestacion sin formar dedos, similar al doble mutante Hoxa13-/-;Hoxd13-/ . Sin embargo, las alteraciones de expresion de los centros de senalizacion no son suficientes para explicar el fenotipo. En la busqueda de una explicacion para explicar dicho fenotipo, hemos analizado la expresion de Hoxa13-exon1 que nos demuestra la presencia de progenitores del autopodio. Estos progenitores son capaces de comenzar la diferenciacion condrogenica como lo demuestra la expresion de Sox9 y Col2, sin embargo nunca se observan las condensaciones individuales de los dedos, indicando que los genes 5'Hox son fundamentales para este proceso. Para valorar la posible alteracion de la expresion de los genes Hoxa y Hoxd que permanecen en nuestro doble mutante, hemos analizado la expresion genica de Hoxd4, Hoxd9, Hoxd10 y Hoxa11. Nuestros resultados demuestran que la presencia de los productos 5'HOX en el segmento distal del esbozo de extremidad es necesaria para la correcta expresion espacial de los genes pertenecientes a los clusters HOXA y HOXD durante el desarrollo de la extremidad Para conocer el papel de los genes Hox en el control del numero de dedos, analizamos los fenotipos resultantes de la perdida de los genes 5'Hox, tanto en ausencia como en presencia de Gli3. La eliminacion de Hoxa13 o de Hoxd11-13 del raton mutante de Gli3 aumenta la polidactilia tipica de este mutante. Sorprendentemente, el mayor numero de dedos hasta ahora conocido se forma en el mutante Gli3-/- ; HoxdDel(11-13)/Del(11-13) ; Hoxa13+/- , con una downregulacion extrema de los genes 5'Hox. Los resultados observados despues de la eliminacion progresiva de los genes 5'Hox del mutante de Gli3 y vice versa nos indican que ambos genes 5'Hox y Gli3 regulan negativamente el numero de dedos y lo hacen de una forma dependiente de la dosis. Finalmente, nuestros resultados nos sugieren que la correcta expresion espacial y temporal de los genes Hox y un correcto balance entre las proteinas 5'HOX y GLI3R es necesario para la formacion de patron en el segmento distal del esbozo de extremidad y para que se establezca la pentadactilia tipica de la extremidad de los tetrapodos.