Untersuchungen zur rekombinanten Proteinproduktion und Tetrapyrrolbiosynthese in Bacillus megaterium

In den letzten Jahren wurde Bacillus megaterium als Wirt fur die Produktion rekombinanter Proteine stetig verbessert. Trotzdem bestehen Limitierungen. So verringert eine schlechte Codonanpassung eines rekombinanten Gens die Menge an rekombinatem Protein. Daher wurde im ersten Teil dieser Arbeit der Einfluss coexprimierter tRNA-Gene auf die rekombinante Proteinproduktion in B. megaterium untersucht. Mit einem artifiziellen Codontestsystem mit dem grun fluoreszierenden Protein (GFP) als Reporter konnte gezeigt werden, dass durch Coexpression von seltenen tRNA-Genen der negative Einfluss von Clustern gleicher seltener oder favorisierter Codons im 5‘-Bereich des gfp-Gens eliminiert und die rekombinante Produktion sogar bis zu 4,2-fach verbessert werden konnte. Zudem konnte gezeigt werden, dass die Coexpression von einzelnen und mehreren seltenen tRNA-Genen die Produktion von rekombinanten intra- und extrazellularen Proteinen, deren Gensequenz nativ und codonoptimiert vorlag, beeinflusst. Neben der Inhibierung des Wachstums durch starke metabolische Belastung, verringerter oder unveranderter Produktion konnte die rekombinante Produktion bis zu 18-fach, unabhangig von der Sequenz des Gens, gesteigert werden. So konnte in dieser Arbeit erstmals durch Coexpression von tRNA-Genen, die seltene Codons bedienen, neben der Produktion rekombinanter Proteine auch die generelle Translationseffizienz in B. megaterium erhoht werden und somit die Grundlage fur einen B. megaterium Stamm mit verbesserter Produktionskapazitat geschaffen werden. Seit langem wird spekuliert, dass zwei aufeinanderfolgende Proteine der Tetrapyrollbiosynthese, die Porphobilinogendesaminase (HemC) und die Uroporphyrinogen-III-Synthase (HemD) einen Komplex bilden, um das labile Produkt von HemC, Preuroporphyrinogen, direkt an das Folgeenzym, HemD, weiterzugeben. In dieser Arbeit konnten uber in vivo Analysen (Bacterial Two-Hybrid Assay; Forster-Resonanzenergietransfer) mit den Enzymen HemC und HemD aus B. megaterium Hinweise auf eine Interaktion erlangt werden. Fur in vitro Analysen wurden die Proteine erfolgreich in grosen Mengen in E. coli hergestellt und aufgereinigt. Cokristallationsansatze und Co-Immunoprazipitationsversuche konnten die Hinweise aus den in vivo Analysen zunachst nicht bestatigen, was jedoch mit Pulldownexperimenten moglich war. Somit bestatigt diese Arbeit eindeutig die Spekulation der Komplexbildung zwischen HemC und HemD.