In vitro- und in vivo-Expressionsstudien von TIP2-markierten Proteinen inSalmonella Typhimurium

Zum besseren Verstandnis der Virulenz pathogener Organismen und zur Entwicklung neuer Strategien diese zu bekampfen ist die Kenntnis welche Proteine wann und in welchen Mengen wahrend einer Infektion exprimiert werden von groser Bedeutung. In dieser Arbeit sollte daher ein genetisches Regulationssystem im Modellpathogen Salmonella Typhimurium etabliert werden mit dem nicht nur die Expression eines Proteins sondern auch Veranderungen seiner Expression unter Infektionsbedingungen in Zellkultur- und in vivo-Modellen nachgewiesen werden sollten. Das verwendete Regulationssystem koppelt die Expression eines Zielproteins, welches mit der kodierenden Sequenz eines TIPs (TetR induzierendes Peptid) fusioniert wurde, an die Expression eines Reportergens, das unter Kontrolle des Regulatorproteins TetR steht. Zu Beginn der Arbeit wurden einzelne Komponenten des Regulationssystems gepruft, um die Induktion der Reportergenexpression zu optimieren. Dabei zeigte die Kombination des Regulators TetR mit dem Induktor TIP2 bessere regulatorische Eigenschaften als die bisher verwendete Kombination TetR/F86A mit WTIP. Auserdem liesen sich Zwei-Vektor Stamme von S. Typhimurium, bei denen die Expressionskassetten fur Regulator und Reporter an zwei unterschiedlichen Orten im Genom integriert worden waren sensitiver induzieren als Ein-Vektor Stamme in denen Reporter und Regulator divergent in einer einzigen Kassette angeordnet waren. Daher wurden Zwei-Vektor Regulatorstamme in allen weiteren Experimenten eingesetzt. Die Fusion von TIP-Sequenzen an den N- und C-Terminus von Trx1 und HPr zeigte in fast allen Fallen Induktion von TetR, aber mit unterschiedlicher Effizienz. Trx1-TIP2 stellte die effizienteste Fusion dar und die Modifikation der Linker-Sequenz zwischen dem Tragerprotein HPr und TIP2 verbesserte die Induktionseffizienz der HPr-TIP2 Fusion. Eine direkte Korrelation zwischen Proteinmengen unterschiedlicher TIP Fusionsproteine und der Induktionseffizienz von TetR ist jedoch nicht fur alle Fusionen gegeben. Nach chromosomaler Fusion von TIP2 an die kodierenden Sequenzen der Haushaltsfaktoren Trx1 und HPr waren die Fusionsproteine ebenfalls in der Lage TetR zu induzieren, wenn sie von ihrem nativen Locus aus exprimiert wurden. Dabei waren in vitro auch Unterschiede in der Induktionseffizienz der Fusionsproteine messbar, die durch Wechsel des Kulturmediums oder durch Wechsel der Kohlenstoffquelle im Medium verursacht wurden. Die Fusion von TIP2 an Virulenzfaktoren zeigte fur plasmidkodierte Fusionen nicht immer eine Induktion von TetR. Fur endogen kodierte Virulenzfaktor-TIP2 Fusionen wurde fur keinen der Faktoren SseJ-TIP2, SopB-TIP2, SifB-TIP2 oder SptP- TIP2 eine Induktion des Systems gemessen. Adhasions-, Invasions- und Replikationsassays in HeLa- und murinen Makrophagenzellen bestatigten die Virulenz der generierten Regulator- und Messstamme. In einem Zellkultur-Infektionsmodell in Makrophagen wurde die Induktion des Regulationssystems durch endogen kodierte TIP2 Fusionen an Trx1 und HPr gezeigt. Diese aktiven Messstamme wurden anschliesend im Rahmen von Maus- Infektionsexperimenten mit C57BL/6 Mausen analysiert. Wahrend im Enterokolitis-Modell in Streptomycin-vorbehandelten Mausen in vivo nur schwache Signale bei lokal begrenzter gastrointestinaler Infektion detektiert wurden, gab es bei systemischer Infektion in nicht mit Streptomycin-vorbehandelten Mausen starkere Lumineszenz-Signale in Milz und Leber. Diese wurden durch Verwendung sensitiverer Messstamme noch weiter verstarkt. Die Amplifikation erwies sich dabei insofern als problematisch, da sie keine Unterscheidung mehr zwischen den Messstammen selbst und dem Stamm mit einer konstitutiven luc Expression zulies. Die Anwendung des Systems unter in vivo Bedingungen ist moglich, jedoch nicht der direkte Vergleich zweier verschiedener TIP2-markierter Proteine.