Identificação de marcadores moleculares de diagnóstico e virulência em Leishmania por bioinformática

Apos 10 anos da publicacao do primeiro genoma completo de uma especie de Leishmania, os avancos na tecnologia de sequenciamento proporcionaram um grande acumulo de informacoes genomicas, transcriptomicas e proteomicas do genero. A convergencia destas informacoes omicas aliadas a ferramentas de bioinformatica permite auxiliar na identificacao de novos marcadores moleculares e determinacao de caracteristicas especificas do parasita. Sendo assim, o foco desse trabalho foi integrar esses dados com os recursos de bioinformatica para contribuir em importantes questoes biologicas: a identificacao de novos biomarcadores para diferenciacao das especies e que contribuem para determinacao de virulencia. Para tanto, foi desenvolvido uma ferramenta web capaz de rastrear genomas completos a fim de identificar conjuntos de primers taxon-especificos para genotipagem por PCR Multiplex. Esta ferramenta, nomeada TipMT, foi capaz de identificar 19.314 pares de primers utilizando os genomas de diferentes especies de Leishmania como entrada para o programa. Na validacao experimental verificou-se a eficiencia dos pares de primers gerados pela ferramenta, capazes de diferenciar tres especies, L. major, L. braziliensis e L. infantum. TipMT oferece uma combinacao de caracteristicas que nao esta presente em outras aplicacoes web com a mesma finalidade: aceita multiplas sequencias como entrada, identifica regioes alvo automaticamente, testa a especificidade dos primers e como saida, gera um arquivo texto com as informacoes gerais dos primers e um gel de eletroforese virtual. Em uma segunda parte do trabalho, foi avaliada a diferenca do perfil de expressao de promastigotas com alta e baixa infectividade em L. amazonensis por RNA-seq. Nessa analise de transcriptomica, avaliou-se a expressao genica de parasitos recem isolados de camundongos experimentalmente infectados e de parasitos que foram mantidos por 30 passagens de cultura in vitro. A avaliacao de infectividade das amostras confirmou a diminuicao da taxa de infeccao apos diversas passagens em cultura axenica. O sequenciamento pela plataforma Illumina HiSeq 2000 gerou um total de 27,35 milhoes de leituras e esses transcritos foram mapeados no genoma de referencia de L. amazonensis com uma percentagem media de 86,57%. Identificou-se 626 genes com expressao diferencial significativa, sendo 66,13% com expressao diminuida apos o cultivo in vitro seriado. Apos 30 passagens in vitro foi detectada uma diminuicao bastante significativa na expressao de genes, ja descritos como envolvidos na infectividade, como a metalo-peptidase GP63, a triparedoxina peroxidase e a proteina de heatshock HSP70. A identificacao das vias metabolicas mostrou que a perda de infectividade esta relacionada a alteracoes no metabolismo, dados corroborados por estudo anterior utilizando tecnicas de proteomica. Considerando esses resultados, a virulencia em Leishmania pode estar associada com a eficiencia de tres processos: a interacao parasito-hospedeiro mediada por proteinas de superficie do parasito; resposta ao estresse oxidativo; e metabolismo de aminoacidos e acidos graxos. Os genes potencialmente associados a virulencia de Leishmania apontados por esse estudo sao, portanto, candidatos para posteriores estudos funcionais.