复制缺陷型重组腺病毒Adeno—X—脑源性神经营养因子的构建与鉴定

目的制备能高水平表达大鼠脑源性神经营养因子（BDNF）的复制缺陷型重组腺病毒。方法首先TRIzol法提取大鼠脊髓组织总RNA。逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）方法扩增BDNF基因并将其克隆入pMD18-T载体测序，测序后将其插入pShuttle2中。然后利用体外连接法将BDNF基因克隆入Adeno-X^TM腺病毒骨架中。脂质体法转染HEK 293细胞包装携带BDNF基因的重组腺病毒。少量提取重组腺病毒DNA利用PCR法检测为复制缺陷型BDNF基因重组腺病毒后大量扩增，蛋白电泳及Western blot法检测BDNF基因在HEK 293细胞中的表达。结果成功构建了能高水平表达大鼠BDNF的复制缺陷型重组腺病毒。结论利用Adeno-X^TM系统体外连接法可方便、快捷的构建BDNF基因复制缺陷型重组腺病毒，并可在体外高水平表达其所携带的目的基因。