HIV-1 nef基因的克隆及原核表达研究

目的：构建HIV-1 Nef基因的原核表达载体并在大肠杆菌中进行表达,初步优化其表达条件。方法：利用特异性引物PCR扩增获得HIV-1 Nef基因片段,PCR产物经限制性内切酶双酶切后连接载体pET24a（＋）,构建重组质粒pET24a（＋）-Nef。经双酶切鉴定及序列测定后的重组质粒转化入E.coliBL21,IPTG诱导表达目的蛋白,优化表达条件,SDS-PAGE及Western blot分析鉴定表达产物。结果：PCR扩增获得618bpDNA片段,酶切鉴定结果表明HIV Nef基因已克隆入原核表达载体pET24a（＋）中,测序证明序列正确。SDS-PAGE和Western blot分析证实重组菌诱导后可表达相对分子质量（Mr）符合预期的融合蛋白。0.1mmol/LIPTG在37℃诱导6h为最佳表达条件,重组蛋白表达量可由15.8%增加到43.9%。结论：在大肠杆菌中成功地表达了HIV Nef蛋白,并初步获得了最优化的表达条件。