腺病毒载体Ad—BDNF—EGFP的构建和在神经干细胞中的表达

目的研究腺病毒载体Ad—BDNF—EGFP的构建及其在神经干细胞（NSCs）中的表达。方法通过RT—pcR从大鼠海马中获得BDNF基因，通过基因克隆、HEK293包装，获得含增强绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒表达载体pAd—BDNF-EGFP，将其感染原代培养的神经干细胞，观察EGFP及BDNF2种基因的表达，镜下测定转染率，并检测RT-PCR产物，证实BDNF的存在。转染后的神经干细胞经G418筛选，抗性细胞传代扩增后获得成功转染BDNF基因的NSCs克隆。结果荧光显微镜下可见感染后的NSCs表达EGFP而发出绿色荧光；通过RT-PCR证明感染后的NSCs具有表达BDNF的能力；用ELISA鉴定细胞上清中分泌的BDNF，72h的含量达到最高值，为12．78ng／mL；证明通过构建病毒的感染可以使神经干细胞获得分泌BDNF的能力，且EGFP基因可作为神经干细胞移植研究中良好的示踪剂。结论腺病毒病毒介导EGFP基因及BDNF基因在大鼠胚胎神经干细胞中成功表达，为应用以神经干细胞直接作为基因靶细胞，介导基因治疗中枢神经系统疾病奠定了基础。