Zell- und molekularbiologische Studien zur zellautonomen anti-chlamydialen Abwehr dendritischer Zellen und natürlicher Killerzellen

Dendritische Zellen (DCs) und die von ihnen geprimten T-Zellen besitzen eine zentrale Funktion in der anti-chlamydialen Immunantwort. In Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe gelang unter Verwendung von immortalisierten murinen DCs (JAWSII-Zellen) und dem Chlamydienstamm C. psittaci (DC15) die erstmalige Identifizierung eines zellautonomen Abwehrweges in infizierten DCs. Diese zellulare Selbstverteidigung ist dadurch charakterisiert, dass Chlamydien aus strukturell desintegrierten Inklusionen dem Autophagieweg zugefuhrt werden und es zur Generierung von Antigenen kommt, die mithilfe von MHCI-Molekulen auf der Zelloberflache von DCs entsprechenden CD8+ T-Zellen prasentiert werden. Die exakten zellularen Prozesse und biochemischen Ablaufe der Desintegration und Autophagie chlamydialer Inklusionen in DCs wurden bisher noch nicht eingehend untersucht. Ziel dieser Arbeit war es daher, unter Einsatz des zuvor etablierten murinen Infektionssystems sowie C. psittaci (DC15), den xenophagosomalen Mechanismus der Chlamydienbekampfung infizierter DCs aufzuklaren und weitere, hieran gekoppelte Folgeprozesse und funktionale Interaktionen mit anderen Immunzellen zu charakterisieren. Die hier in Kombination mit zellbiologischen und biochemischen Assays durchgefuhrten siRNA-Studien belegen eine funktionale Schlusselrolle der Phospholipase cPLA2 in der anti-chlamydialen Abwehr infizierter DCs. Des Weiteren sprechen die Resultate dafur, dass es durch die Wirkung der von ihr synthetisierten Arachidonsaure zu einer defekten OXPHOS und verminderten ATP-Produktion der Mitochondrien kommt und dies destruktive Auswirkungen auf die energieparasitaren Chlamydien hat. Der Verlust der mitochondrialen Funktion sowie der damit verbundene Vitalitatsverlust der Chlamydien scheinen unmittelbar durch den TNF-α/cPLA2-Signalweg kontrolliert zu werden. Des Weiteren lassen die Ergebnisse der Arbeit folgern, dass die Chlamydieninfektion mit einer metabolischen Umprogrammierung von der OXPHOS zur aeroben Glykolyse in DCs einhergeht. Durch die erhohte Glykolyserate scheinen die infizierten DCs, den durch die geschadigten Mitochondrien entstehenden Energieverlust, kompensieren zu konnen. Die Assoziation der Inklusionen mit stabilen, acetylierten Mikrotubuli spielt eine entscheidende Rolle sowohl fur die erfolgreiche Etablierung der Chlamydien als auch deren vesikulare Versorgung. Die hier durchgefuhrten Untersuchungen zeigen in infizierten DCs eine HDAC6-vermittelte Deacetylierung von Mikrotubuli. Dies fuhrt zu einem Verlust des peri-nuklearen Transports bakterieller Vakuolen zum Golgi-Apparat und einer weiteren strukturellen Desintegration der chlamydialen Kompartimente. Der Vorgang ermoglicht es infizierten DCs, die durch cPLA2/Arachidonsaure beeintrachtigen Inklusionen von der vesikularen Versorgung abzukoppeln und durch weitere intrazellulare Mechanismen zu eliminieren. Die durchgefuhrten Untersuchungen zum intrazellularen Abbaumechanismus weisen auf eine Aggresomen-vermittelte Xenophagie der bakteriellen Strukturen hin. Massenspektrometrische Analysen der Aggresomen aus DCs sowie die gefundene Beteiligung der mitophagosomalen Schlusselkomponenten HDAC6, Parkin, Pink-1 sowie p62 und Ubiquitin belegen einen simultanen auto-/xenophagosomalen Abbau defekter Mitochondrien und desintegrierter Chlamydien. Eine vergleichbare intrazellulare anti-chlamydiale Abwehr konnte ebenfalls in primaren Maus- aber auch humanen DCs bestatigt werden. Wahrend des Infektionsverlaufs in DCs kommt es parallel zur Auto-/Xenophagie zu einer vermehrten Bildung von Multivesikularkorperchen (MVBs) und einer daran gekoppelten Formation exosomaler Membranvesikel (iDexosomen), die massiv zur Induktion der IFN-γ-Sekretion benachbarter NK-Zellen und so zur Aktivierung einer NK-Zellantwort wahrend der Chlamydieninfektion beitragen. Weitere Untersuchungen zeigen, dass das TNF-α infizierter DCs in Kombination mit dem durch iDexosomen induzierten IFN-γ von NK-Zellen zu einer erhohten Apoptoseinduktion nicht-infizierter aber auch Chlamydien-infizierter Epithelzellen fuhrt. Dies deutet darauf hin, dass die chlamydiale Subversion der Apoptose infizierter Zellen zu einem gewissen Teil durch eine kombinatorische Wirkung von Exosomen, IFN-γ und TNF-α „ausgehebelt“ werden kann. Abschliesend wurde in dieser Arbeit untersucht, ob und in welchem Mase die mit DCs kooperierenden NK-Zellen zellulare Mechanismen besitzen, die eine zellulare Chlamydieninfektion direkt bekampfen. Die Ergebnisse der Untersuchungen zeigen, dass es bei infizierten NK-Zellen zu keinem Zeitpunkt zu einer erfolgreichen chlamydialen Etablierung und zu keiner zyklusvermittelten EB-RB-Differenzierung kommt. Interessanterweise zeigen die infizierten NK-Zellen eine funktionale Reifung, die durch eine erhohte IFN-γ-Sekretion, CD146-Induktion, PKC-θ-Aktivierung und Granula-Ausschuttung charakterisiert ist und mit einer Freisetzung von nicht-infektiosen EBs einhergeht. Diese Ausschleusung von Chlamydien konnte hier sowohl fur immortalisierte als auch primare NK-Zellen der Maus gezeigt werden und lasst sich durch die pharmakologische Blockierung zellularer Exozytoseprozesse inhibieren. Chlamydiale Strukturen innerhalb der NK-Zellen weisen in der Immunfluoreszenz und Elektronenmikroskopie eine ausgepragte Co-Lokalisierung mit sekretorischen Granula auf. Es scheint, dass das Granula-lokalisierte und ausgeschuttete Granzym B verantwortlich fur den beobachteten Infektionsverlust, der durch NK-Zellen freigesetzten EBs, ist. Die chlamydiale Infektion und Ausschleusung von EBs hat keinen detektierbaren negativen Einfluss auf die Funktion der NK-Zellen. Sie konnen nach einer Erstinfektion den chlamydialen Infektions- und Ausschuttungsvorgang in einer weiteren Reaktion reproduzieren und besitzen eine zytotoxische Aktivitat, die denen nicht-infizierter NK-Zellen entspricht oder sogar leicht erhoht ist. Die von NK-Zellen freigesetzten nicht-infektiosen Chlamydien zeigen eine nachweisbare Immunogenitat, die laut IgG-Subklassen-Charakterisierung immunisierter Mause zu einer IgG2c-/IgG2b-dominierten Th1-Antwort fuhrt. Die wahrend der Immunisierung generierten anti-chlamydialen Antikorper besitzen zudem die Fahigkeit zur Infektionsneutralisierung bei der Verwendung epithelialer Wirtszellen als Modelsystem. Im Resume geben die Ergebnisse dieser Forschungsarbeit neue und vertiefende Einblicke in die zellularen und molekularen Abwehrmechanismen Chlamydien-infizierter DCs und NK-Zellen sowie in deren funktionale wechselseitige Kooperation wahrend der anti-chlamydialen Immunreaktion durch iDexosomen, TNF-α und IFN-γ.