DESENHO RACIONAL IN SILICO E SÍNTESE ARTIFICIAL DE UM CONSTRUCTO PARA EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS HETERÓLOGAS

Os sistemas de expressao heterologa de proteinas tem sido extensivamente utilizados para a obtencao de proteinas especificas em quantidade suficiente para estudos de sua estrutura e funcao ou para aplicacoes clinicas e/ou industriais. O sistema mais comumente utilizado para expressao de proteinas heterologas e o que utiliza Escherichia coli como celula hospedeira. Tal sistema e amplamente difundido devido a facilidade e baixo custo de se cultivar E. coli e pela abundância de proteinas que produz. Alem disso, modificacoes nos vetores e linhagens de E. coli sao frequentemente feitas no sentido de aumentar a eficiencia e versatilidade do sistema original. Os plasmideos de expressao bacterianos contem, basicamente, um promotor forte e regulado e um sitio de multipla clonagem (SMC), alem de origem de replicacao procariotica (OR) e do marcador genetico (MG), que geralmente confere resistencia a determinado antibiotico. Os principais plasmideos de expressao bacterianos utilizam os promotores lac, tac e T7. O procedimento de clonagem de um fragmento de DNA para expressao e exatamente igual a qualquer clonagem, no entanto, deve se ter em mente que o proposito sera obter a proteina traduzida corretamente. Para tanto, e necessario respeitar o sinal de transcricao e traducao de genes procarioticos, alem da fase de leitura e a ausencia de introns no caso de regioes codantes de genes eucarioticos. Neste processo sao necessarias clonagens subsequentes que acabam por aumentar o custo e o tempo dos experimentos. Desta forma, o trabalho objetiva desenvolver um vetor de expressao que nao necessita sublonagens, utilizando apenas um evento de clonagem e de transformacao da bacteria de expressao. O constructo para expressao foi desenhado racionalmente in silico a partir de um promotor lac responsivo a IPTG, seguido por um sinal de exportacao celular (peptideo-sinal), um fragmento strep-tag para purificacao e uma sitio para trombina, permitindo a clivagem da proteina de interesse dos tags fusionados. Foram inseridos dois sitios para endonucleases de restricao (X e Y) que permitem a clivagem do gene clonado no constructo, localizados entre o strep-tag e o sitio para trombina. O constructo foi sintetizado artificialmente (IDT Technologies). Como perspectiva, serao realizados testes de expressao qualitativa e quantitativa com a clonagem da regiao codante sem introns de um gene humano e determinacao da funcao da proteina produzida e purificada.