New methods for fluorescence labelling of human rhinovirus in live cell imaging

Diese Thesis behandelt die Insertion eines RNA-Aptermers, genannt Spinach, welches mit dem kleinen Molekul DFHBI einen fluoreszierenden Komplex bildet, in das Genom des humanen Rhinovirus 14 (HRV-14). Damit soll es ermoglicht werden die virale RNA wahrend eines gesamten Infektionszykluses in der Zelle zu beobachten um neue Erkenntnisse uber die gesamte Replikation des Viruses zu erhalten, welcher am haufigsten mit der gemeinen Erkaltung assoziiert ist. Die Sequenz des Aptamers musste in nicht kodierende Regionen des Genoms insertiert werden, wo auch bereits bekannte Schlusselstrukturen wie „Cloverleaf“ und „IRES“ intakt bleiben mussten. Das reduzierte die Anzahl der moglichen Stellen auf 4 Positionen: In der 5‘-UTR jeweils vor und nach dem Cloverleaf und zwei in der 3‘-UTR. Um die Stabilitat der Konstruktionen und um ungewunschte Strukturbildung vorherzusagen wurde die Vienna RNA Websuite verwendet. Die Einfugung des Aptamers resultierte in drei Fallen in einem defekten Virus, wobei das Ausmas von der Position des Aptamers abhing. Das vierte Konstrukt zeigte Wachstumsraten vergleichbar mit dem nativen Virus, trug jedoch ein nicht fluoreszierendes Aptamer mit sich. Zwei der drei leuchtenden rekombinanten Viren konnten in HeLa-Zellen gezuchtet werden, zeigten sich jedoch genetisch instabil und deletierten das Aptamer interessanterweise punktgenau. Drei Konstrukte fluoreszierten in Gegenwart von DFHBI in vitro und in vivo transifiziert in HeLa Zellen. Die erste Passage von aus Plaques isolierten rekombinanten Viren zeigten ebenfalls Fluoreszenz 5 Stunden nach der Infektion. Als ein weiteres Projekt wurde die Einfuhrung eines Tetra-Cystein-Tags in ein Kapsidprotein (entweder VP1 oder VP2) geplant. Wegen des beschrankten Zeitrahmens konnte dies jedoch nicht wahrend der Masterarbeit fertig gestellt werden.