The influence of the RNA helicase Mss116 on CBP2-assisted splicing of the bI5 group I intron in vitro

Um ihre Funktionen korrekt ausfuhren zu konnen muss RNA in ihrer nativen Faltungsform vorhanden sein. Der Faltungsweg hangt von der jeweiligen RNA-Art ab. Bisher wurden RNA-Faltung an katalytisch aktiven RNAs, besonders an Gruppe I Introns untersucht, da die Ausbildung ihres naturlichen Faltungszustandes als katalytische Funktion gemessen werden kann. Introns der Gruppe I sind katalytisch aktiv und konnen in vitro, in Verbindung mit hoher Magnesiumkonzentration, selbst-spleisen. Unter nahezu physiologischen Bedingungen benotigen sie zusatzlich Protein Co-Faktoren, welche die Intronfaltung begunstigen und damit auch das Selbst-spleisen. Zum Beispiel benotigt das mitochondriale bI5 Gruppe I Intron aus Hefe zusatzlich das Cytochrom B pre-mRNA Prozessierungsprotein 2, CBP2, als Co-Faktor fur effizientes Spleisen in vitro und in S.cerevisiae. CBP2 stabilisiert die Struktur von bI5, wenn es spezifisch an das Intron bindet und ermoglicht die Ausbildung von Tertiarstrukturen. Diese Bindung ermoglicht bI5 seine naturliche Faltungsform zu erreichen wodurch das Intron spleisen kann. In vivo wird ein weiteres Protein, Mss116, benotigt um ein effektives Spleisen einzuleiten. Mss116 gehort zu der Gruppe von DEAD-box Helikasen, die das Spleisen aller mitochondrialen Introns, Gruppe I und Gruppe II begunstigt, sowie fur das Aufwinden und Strang-Annealing benotigt wird. Beide Proteine gemeinsam werden zum Spleisen in vivo benotigt. Das Ziel dieser Diplomarbeit ist erste Erkenntnisse uber die Rolle von Mss116 bei CBP2-unterstutzter Faltung vom bI5 Intron in vitro zu gewinnen. Dementsprechend haben wir zuerst das Expressions- und Aufreinigungsprotokoll fur CBP2 angepasst. Nach erfolgreicher Bestatigung, dass CBP2 das bI5 Spleisen in vitro unter nahezu physiologischen Bedingungen begunstigt, haben wir gezeigt, dass CBP2 keinen Einfluss auf die ATPase Aktivitat von Mss116 hat. Dies erlaubte uns weiter das Spleisverhalten von bI5 in Abwesenheit sowie Anwesenheit von einem oder beiden Proteinen zu untersuchen. Wir bestimmten die Spleiseffizienz von bI5 durch gleichzeitige Zugabe von Mss116 und CBP2 zu der denaturierten bI5 pre-RNA oder durch Zugabe von Mss116 zum CBP2-bI5 Komplex. In beiden Fallen forderte Mss116 das CBP2-unterstutze bI5 Spleisen. Dies wird durch die 2-fach – 5.5-fach erhohte Geschwindigkeitskonstante, verglichen mit CBP2-unterstutztem bI5 Spleisen in Abwesenheit von Mss116, gezeigt. Wenn sowohl Mss116 als auch CBP2 in hoherer Konzentration vorhanden waren, stieg die Spleisrate nur 2-fach an. Eine Erklarung dafur ware, dass Mss116 den CBP2-RNA Komplex bis zu einem gewissen Grad stort und somit die Spleiseffizienz senkt. Folglich ist der Zeitpunkt der Mss116-Zugabe kein entscheidender Faktor; Mss116 durfte sowohl fruhere als auch spatere Faltungsschritte wahrend dem CBP2-unterstutzten bI5 Faltungsweg beeinflussen. Zuletzt erwogen wir die Moglichkeit, dass Mss116 nur benotigt wird um die Faltung von vollstandigem Intron zu begunstigen. Dementsprechend untersuchten wir verschiedene Bedingungen, welche das Selbst-spleisen des vollstandigen bI5 Introns mit kurzen Exons in Anwesenheit beider Spleisfaktoren ermoglichen wurden. Bisher wurde aber kein Spleisen dieses Konstruktes unter verschiedensten Bedingungen beobachtet. Es ist moglich, dass Mss116 nicht unbedingt fur die korrekte Faltung von grosen peripheren Verlangerungen notwendig ist, jedoch fur die Auflosung inhibitorischer Strukturen in den Exons. Solch eine Rolle wurde auch beim ai5γ Gruppe II Intron, welches lange Exons enthalt, vorgeschlagen.