Human sperm transcriptome : characterization, biological relevance, and biomarker functionality

Se ha demostrado que la contribucion del espermatozoide al embrion va mas alla de la transmision del genoma paterno. Diversos estudios han mostrado que el espermatozoide humano contiene una compleja poblacion de RNAs implicados en funciones relacionadas con la fertilidad. Por tanto, la vision de estas moleculas como meros restos de eventos previos ha quedado atras. Este nuevo paradigma abre las puertas a nuevas aplicaciones del RNA en el ambito de los biomarcadores de fertilidad. Sin embargo, los analisis transcriptomicos en espermatozoides presentan diversas limitaciones debidas a la heterogeneidad y delicada naturaleza de estas moleculas, ademas de la poca cantidad de RNA contenida en dichas celulas.En este contexto, el objetivo de esta Tesis Doctoral es caracterizar el transcriptoma del espermatozoide humano y establecer las bases para desarrollar nuevos biomarcadores de fertilidad masculina. Dentro de este objetivo, se plantearon las siguientes metas: 1) optimizar metodologias especificas para analizar el RNA espermatico mediante qRT-PCR y RNA-seq; 2) proporcionar un perfil integrado y una caracterizacion funcional de los mRNAs y lncRNAs espermaticos mediante RNA-seq; y 3) establecer nuevos biomarcadores de fertilidad a partir de la carga transcriptomica del espermatozoide.Con este proposito, se adaptaron tanto el protocolo experimental como el analisis de datos a las limitaciones propias del RNA espermatico y a la tecnologia transcriptomica usada. Por tanto, se implementaron metodos de eliminacion de celulas no espermaticas de las muestras seminales, asi como controles de calidad para asegurar la ausencia de DNA y RNA no espermatico. Ademas, se uso un metodo basado en solventes organicos para los estudios qRT-PCR, y kits de solventes no organicos para RNA-seq.Los datos obtenidos se normalizaron usando metodos especificos de la tecnica empleada. En concreto, para la normalizacion de los datos de expresion de miRNAs espermaticos en estudios singleplex qRT-PCR era necesario establecer miRNAs normalizadores. Esto se consiguio comparando los resultados derivados de unos datos que se normalizaron mediante: i) el metodo Mean-Centering Restricted (MCR); y ii) el nivel de expresion de diferentes miRNAs. Los miRNAs hsa-miR-100-5p y hsa-miR-30a-5p mostraron una expresion estable y ubicua, y su uso derivo en resultados con una calidad semejante a los conseguidos mediante la normalizacion por MCR. Por tanto, se sugirio esta combinacion de miRNAs como la mejor opcion para la normalizacion de futuros estudios singleplex qRT-PCR de miRNAs espermaticos.Por otro lado, se empleo RNA-seq, para caracterizar el transcriptoma espermatico de individuos fertiles. Los resultados revelaron una red de mRNAs y lncRNAs en alto estado de fragmentacion, pero que contenian un grupo de transcritos ubicuos. Los analisis de Ontologia Genica de todos los mRNAs expresados mostraron una implicacion en procesos de espermatogenesis y reproduccion, la cual era mas significativa en los analisis de los mRNAs altamente expresados, ubicuos y altamente estables. Aparte, los potenciales genes dianas en cis de los lncRNAs mostraron relacion con procesos de desarrollo embrionario y adhesion celular, la cual prevalecia en los genes dianas que no estaban expresados en espermatozoides.Finalmente, el hecho de hallar transcritos ubicuos y de expresion correlacionada indico un posible uso de estas moleculas como biomarcadores de fertilidad. Por tanto, se evaluo y se valido la presencia de pares de miRNAs espermaticos con una expresion correlacionada en individuos fertiles y no correlacionada en pacientes infertiles de diferentes etiologias (astenozoospermia, teratozoospermia, oligozoospermia e infertilidad inexplicable [UMI]). El par hsa-miR-942-5p/hsa-miR-1208 permitio clasificar correctamente el 85.71% de los casos de infertilidad, alcanzando el mayor potencial de diagnostico de pacientes con alteraciones seminales. El par hsa-miR-34b-3p/hsa-miR-93-3p destaco por su potencial para discernir pacientes UMI. Aparte, varios pares de mRNAs y lncRNAs tambien mostraron expresiones correlacionadas en individuos fertiles, constituyendo unos candidatos potenciales para futuros estudios.