pGL3／EGRl-Bax重组载体的构建及对非小细胞肺癌细胞的转染

目的构建早期生长反应基因1（EGRl）启动子与Bax基因共表达载体pGL3／EGRl-Bax并转染非小细胞肺癌细胞。方法以小鼠脑组织基因组DNA为模板，采用PCR法分别扩增EGRl和Bax基因全长编码序列，分别克隆入载体pTA2，构建重组质粒pTA2／EGRl和pTA2／Bax，测序鉴定；再将EGRl与Bax基因亚克隆至pGL3-Basic载体中，构建双基因共表达载体pGL3／EGRl-Bax，测序鉴定。采用基因转染技术将基因导人非小细胞肺癌NCI—H460细胞，分别以未转染及空pGL3一Basic载体转染的NCI—H460细胞株作为空白对照组和阴性对照组，采用RT-PCR技术和Westernblotting方法检测NCI—H460细胞EGRl和BaxmRNA和蛋白的表达。结果测序鉴定证实，构建的双基因共表达载体pGL3／EGRl-Bax的EGRl、Bax序列与GenBank发布基因序列完全一致。与对照组和空载体转染组NCI—H460细胞比较，pGL3／EGRl-Bax转染组NCI—H460细胞中EGRl和Bax的mRNA表达以及Bax的蛋白表达明显增强。结论成功构建双基因共表达载体pGL3／EGRl-Bax，并实现了EGRl和Bax基因在NCI—H460细胞中的有效表达。