基于CRISPR/Cas9加工番茄 α-Man 突变体的构建

为培育成熟果实软化程度低，货架期长的番茄植株，以加工番茄甘露糖苷酶基因(α-Man)为编辑对象，设计由番茄U6启动子驱动、长21 bp的guide RNA(gRNA)指导hCas9核酸酶，靶向编辑α-Man的第1个外显子。首先构建基于CRISPR/Cas9系统的植物表达载体，并通过农杆菌介导的遗传转化获得加工番茄转基因株系，然后取转基因番茄叶片基因组DNA，利用限制性内切酶法结合PCR扩增对α-Man编辑位点附近的DNA片段进行检测及测序分析。结果表明，14株转基因番茄植株有2株检测到突变现象。α-Man突变体TA克隆测序结果显示有2种编辑类型，一种表现为52 bp的缺失突变; 另一种表现为单碱基突变。实现了对番茄α-Man的编辑。