Nuevas oxidorreductasas GMC de basidiomicetos ligninolíticos: Screening genómico, mecanismo catalítico y potencial biotecnológico
2017
La superfamilia de enzimas glucosa-metanol-colina (GMC) se compone de proteinas que unen FAD y poseen un plegamiento comun dividido en dos dominios. Algunas oxidorreductasas fungicas que pertenecen a ella son enzimas auxiliares en la degradacion de la lignocelulosa. La mayoria producen el H2O2 requerido por peroxidasas para actuar sobre la lignina o para desencadenar reacciones de Fenton, que producen especies radicales que atacan a la lignocelulosa. El estudio de los genomas de 10 hongos poliporales, unicos organismos capaces de mineralizar totalmente la lignina, desvelo la participacion de 5 familias GMC en la descomposicion de la lignocelulosa. Estas son glucosa oxidasas (GOX), celobiosa deshidrogenasas (CDH), piranosa 2-oxidasas (P2O), metanol oxidasas (MOX) y aril-alcohol oxidasas (AAO). Estudios filogeneticos sugieren que su diversificacion ocurrio en una etapa temprana de la evolucion fungica, caracterizada por el escaso numero de genes GMC. AAO y MOX son las GMC mas abundantes en los 10 genomas, aunque sus numeros varian entre genomas segun la ecofisiologia de cada hongo. Asi, las oxidorreductasas GMC coevolucionaron junto con las peroxidasas de alto potencial redox durante la especiacion de los hongos. La AAO del basidiomiceto Pleurotus eryngii se selecciono como representante de la superfamilia para estudiar su mecanismo. Esta cataliza la oxidacion de alcoholes aromaticos produciendo los correspondientes aldehidos y la reduccion de O2 a H2O2 en dos semirreacciones. La de reduccion consiste en las abstracciones de un hidruro del carbono ? del alcohol por el FAD y la del proton del grupo hidroxilo por la His502 catalitica. Durante la semirreaccion de oxidacion estas particulas son transferidas al O2 reduciendolo. La funcion del residuo Phe397 en la catalisis de la AAO se estudio mediante la comparacion de las cineticas de estado estacionario y transitorio y estudios de afinidad entre la enzima salvaje y variantes mutadas. Los resultados sugieren que la Phe397 ayuda al producto a abandonar el bosillo catalitico. La dependencia de la temperatura de la catalisis de AAO se estudio con el objetivo de dilucidar la participacion del efecto mecano-cuantico conocido como tunneling de hidrogeno en la transferencia del hidruro durante la reduccion de la enzima. Los datos obtenidos con sustratos protiados y deuterados indican que el efecto tunel esta involucrado en la transferencia. La comparacion de los datos de la AAO salvaje con los de mutantes del residuo Tyr92, asi como estudios cristalograficos, sugieren que la transferencia depende de movimientos proteicos que permiten transferir la particula desde una configuracion organizada antes de la catalisis. Los mecanismos que subyacen a la reoxidacion de la enzima y la produccion de H2O2 se estudiaron mediante cineticas rapidas empleando efectos isotopicos de sustrato y solvente. Tras la transferencia inicial de un electron, la enzima transfiere al O2 un atomo de hidrogeno desde el FAD y un proton desde un lugar de intercambio con solvente en dos procesos quimicos independientes. Asimismo, se evaluo la aplicabilidad biotecnologica de oxidasas GMC para la produccion de acido 2,5-furandicarboxilico (FDCA), un precursor de bioplasticos. La AAO oxida precursores del FDCA derivados de la deshidratacion de la fructosa de la biomasa vegetal, entre ellos 5-hidroximetilfurfural (HMF) y sus derivados parcialmente oxidados. A pesar de su actividad, la AAO no produce FDCA por su incapacidad de catalizar ciertas reacciones. La accion sinergica de una peroxigenasa inespecifica (UPO) del hongo Agrocybe aegerita, capaz de catalizar la produccion de FDCA a expensas del H2O2 generado por AAO, permitio producir FDCA. Asi, se alcanzaron altas tasas de conversion en FDCA con el consumo neto de O2 atmosferico.
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