Dino Grgic

University of Vienna

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45. The troubling tandem: Investigating the interaction of isoflavones and zearalenone on weaning piglets

Animal - science proceedings (2024)

B. Novák Dino Grgic Elisabeth Varga Doris Marko L. Rouxel

Soy Isoflavones

10.1016/j.anscip.2024.06.209

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The impact of N-acetyl cysteine on the chemical composition and toxicity of a naturally occurring mixture of Alternaria toxins

Dino Grgic

Alternaria-Toxine sind eine Gruppe von Lebensmittelkontaminanten, die sich durch eine hohe chemische Vielfalt auszeichnen. Einigen dieser Mykotoxine werden genotoxische Wirkungen, anderen ostrogene Eigenschaften zugeschrieben. Kurzlich konnte gezeigt werden, dass bei einer Inkubation von Zellen mit einer naturlich vorkommenden Mischung von Alternaria-Toxinen, die Ostrogenitat von AOH und AME von der geno- und zytotoxischen Wirkung von ebenfalls enthaltenen Perylenquinonen uberlagert wird. Allerdings sind epoxidhaltige Perylenquinone wie ATX-II sehr reaktiv. Nachdem kurzlich nachgewiesen wurde, dass ATX-II mit bestimmten Lebensmittelinhaltsstoffen spontan reagiert und dadurch entgiftet wird, stellt sich die Frage, ob die Substanz als solche unter physiologischen Bedingungen noch vorhanden ist und daher noch genotoxisch wirken kann. Infolgedessen konnten epoxidische Perylenquinone nur noch eine untergeordnete Rolle spielen und ostrogene Alternaria-Toxine wie AOH und AME ihre Wirkung dennoch entfalten. Daruber hinaus stellt sich die Frage, ob Perylenquinone nach der Reaktion noch antiostrogene Eigenschaften, die bereits fur ATX-II und ein komplexes Gemisch von Alternaria-Toxinen (CE) beschrieben wurden, besitzen. Um die Reaktion mit anderen Nahrungsmittelinhaltsstoffen und Sekreten des Gastrointestinal Trakts zu simulieren, wurde das Antioxidans NAC als moglicher Reaktionspartner fur epoxidische und SH-reaktive Perylenquinone eingesetzt. Es konnte durch Anwendung der Einzelzell-Gelelektrophorese (Comet Assay) gezeigt werden, dass die Co-Inkubation mit NAC zu einer merklichen Verminderung der DNA-strangbrechenden Eigenschaften der Mykotoxine fuhrt. Dies stand im Einklang mit Resultaten aus LC-MS/MS-Messungen, die eine starke Reduktion des ATX-II-Gehalts nach Co-inkubation mit NAC zeigten. Diese Ergebnisse bestatigten die Hypothese, dass ATX-II mit NAC interagiert und es somit zu einer Abnahme der Konzentration von ATX-II kommt, wobei es unerheblich ist, ob die Substanz isoliert oder in Kombination mit anderen Mykotoxinen vorliegt. Daruber hinaus wurde mittels „alkaline phosphatase assay“ ein deutlicher Einfluss von NAC auf eine Kombination von ATX-II und AOH: Der Einfluss von ATX-II auf das ostrogene Potential von AOH konnte durch die Zugabe von NAC zwar gesenkt werden, jedoch konnte das ursprungliche Potential von AOH nicht vollstandig wiederhergestellt werden. Gegenteiliges zeigte sich bei der Co-Inkubation von AOH mit dem komplexen Alternaria Extrakt (CE). Durch die Zugabe von NAC wurde die Verringerung des ostrogenen Potenzials noch ausgepragter. Eine plausible Erklarung fur diesen beobachteten Effekt konnte sein, dass der Extrakt zusatzlich nicht-epoxidische Perylenquinone und andere Toxine enthalt, die nicht mit NAC reagieren, die aber entweder direkt anti-ostrogen wirken oder uber die Aktivierung des Ah-Rezeptors eine Rolle spielen konnten. Der Unterschied zwischen ATX-II und CE konnte anhand von qRT-PCR-Daten beobachtet werden, die auf eine Verringerung der ATX-II-induzierten CYP 1A1-Transkription (welche als Marker fur die Aktivierung des AhRs dient) durch die Zugabe von NAC hinweisen, wahrend die Kombination von CE und NAC die Transkription von CYP 1A1 sogar erhohte. Obwohl eine Kombination von CE und NAC zu einer Verringerung der Genotoxizitat fuhrt, sind die im Extrakt enthaltenen Stoffe weiter im Stande, die Ostrogenitat von AOH zu unterdrucken. Dies konnte durch die Bindung an die AhR erklart werden, die durch eine erhohte Transkription von CYP 1A1 bestatigt wurde. Zusammenfassend lasst sich sagen, dass ATX-II in der Lage ist, die Ostrogenitat von AOH in toxischen Konzentrationen zu unterdrucken. Durch die Reaktion mit NAC (was die Reaktion mit Nahrungsbestandteilen und Korpersekreten simuliert) wird ATX-II sehr schnell zu bislang unbekannten Produkten abgebaut. Infolgedessen kann ATX-II nicht mehr wirken, weder genotoxisch noch durch das Abschwachen der Ostrogenitat von AOH. Dies konnte ein Hinweis darauf sein, dass ATX-II unter physiologischen Bedingungen nur eine untergeordnete Rolle spielt.

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Estrogenic in vitro evaluation of zearalenone and its phase I and II metabolites in combination with soy isoflavones

Archives of Toxicology (2022)

Dino Grgic Andrea Betschler Rebeka Früholz Barbara Novak Elisabeth Varga

Abstract Humans and animals are exposed to multiple substances in their food and feed that might have a negative health impact. Among these substances, the Fusarium mycoestrogen zearalenone (ZEN) and its metabolites α-zearalenol (α-ZEL) and α-zearalanol (α-ZAL) are known to possess endocrine disruptive properties. In a mixed diet or especially animal feed, these potential contaminants might be ingested together with naturally occurring phytoestrogens such as soy isoflavones. So far, risk assessment of potential endocrine disruptors is usually based on adverse effects of single compounds whereas studies investigating combinatorial effects are scarce. In the present study, we investigated the estrogenic potential of mycoestrogens and the isoflavones genistein (GEN), daidzein (DAI) and glycitein (GLY) as well as equol (EQ), the gut microbial metabolite of DAI, in vitro alone or in combination, using the alkaline phosphatase (ALP) assay in Ishikawa cells. In the case of mycoestrogens, the tested concentration range included 0.001 to 10 nM with multiplication steps of 10 in between, while for the isoflavones 1000 times higher concentrations were investigated. For the individual substances the following order of estrogenicity was obtained: α-ZEL > α-ZAL > ZEN > GEN > EQ > DAI > GLY. Most combinations of isoflavones with mycoestrogens enhanced the estrogenic response in the investigated concentrations. Especially lower concentrations of ZEN, α-ZEL and α-ZAL (0.001—0.01 nM) in combination with low concentrations of GEN, DAI and EQ (0.001—0.1 µM) strongly increased the estrogenic response compared to the single substances.

Soy Isoflavones

10.1007/s00204-022-03358-3

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Isoflavones in Animals: Metabolism and Effects in Livestock and Occurrence in Feed

Toxins (2021)

Dino Grgic Elisabeth Varga Barbara Novak Anneliese Müller Doris Marko

Soybeans are a common ingredient of animal feed. They contain isoflavones, which are known to act as phytoestrogens in animals. Isoflavones were described to have beneficial effects on farm animals. However, there are also reports of negative outcomes after the consumption of isoflavones. This review summarizes the current knowledge of metabolization of isoflavones (including the influence of the microbiome, phase I and phase II metabolism), as well as the distribution of isoflavones and their metabolites in tissues. Furthermore, published studies on effects of isoflavones in livestock species (pigs, poultry, ruminants, fish) are reviewed. Moreover, published studies on occurrence of isoflavones in feed materials and co-occurrence with zearalenone are presented and are supplemented with our own survey data.

10.3390/toxins13120836

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N-acetyl cysteine alters the genotoxic and estrogenic properties of Alternaria toxins in naturally occurring mixtures

Emerging contaminants (2022)

Georg Aichinger Dino Grgic Julia Beisl Francesco Crudo Benedikt Warth

It is unclear if complex mycotoxin mixtures produced by Alternaria spp. act estrogenic and/or genotoxic under physiological conditions, particularly considering the co-occurrence with antioxidants in food. Thus, this study focused on enlightening the impact of N-acetyl cysteine (NAC), as a representative anti-oxidative SH-donor, on the mentioned toxicological endpoints of the signature Alternaria toxins alternariol (AOH), altertoxin-II (ATX-II) and a complex extract (CE) of an Alternaria alternata culture. Using Ishikawa cells as an in vitro model, we monitored alterations in toxin concentrations by LC-MS/MS, estrogenicity by alkaline phosphatase assays, cytotoxicity by sulforhodamine B assays, genotoxicity by single-cell gel electrophoresis and the transcription of selected genes of interest by quantitative real-time PCR. The results indicate that the strong genotoxic effects of epoxide-carrying perylene quinones such as ATX-II are erased in the presence of NAC. The cellular effects of ATX-II/AOH mixtures are dominated by the genotoxicity of the perylene chinone. In this mixture, AOH regained its estrogenicity when co-incubated with NAC. In contrast, NAC treatment of an AOH/CE mixture did not result in a recovery of estrogenicity, but in potentiated anti-estrogenic effects. These findings were in line with gene transcription data, that indicated the aryl hydrocarbon receptor (AhR) to be a prime mediator of Alternaria toxin – induced antagonistic effects towards estrogen receptor signaling. Taken together, further studies on potential endocrine-disruptive properties of non-genotoxic perylene quinones should be a future research priority in the field of these emerging contaminants.

Alternariol

10.1016/j.emcon.2021.12.004

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Estrogen receptor α interaction of zearalenone and its phase I metabolite α-zearalenol in combination with soy isoflavones in hERα-HeLa-9903 cells

Mycotoxin Research (2023)

Dino Grgic Barbara Novak Elisabeth Varga Doris Marko

Abstract Risk assessment primarily relies on toxicological data of individual substances, with limited information on combined effects. Recent in vitro experiments using Ishikawa cells, an endometrial carcinoma cell line expressing both estrogen receptor isoforms, demonstrated interactive effects of phyto- and mycoestrogens. The mycoestrogens, zearalenone (ZEN), and α-zearalenol (α-ZEL) exhibited significantly enhanced estrogenic responses in the presence of isoflavones (ISF), depending on substance ratios and concentrations. This study investigated the impact of phyto- and mycoestrogen combinations on estrogenic response following OECD guideline 455, utilizing hERα-HeLa-9903 cells. Test substances included mycoestrogens (ZEN and α-ZEL) and isoflavones (genistein (GEN), daidzein (DAI), and S-equol (EQ), a gut microbial metabolite of DAI). Mycoestrogens were tested in the range of 0.001 to 100 nM, while isoflavones were used at concentrations 1000 times higher based on relevant occurrence ratios. Results showed that ZEN and α-ZEL induced ERα-dependent luciferase expression in concentrations above 1 nM and 0.01 nM, respectively. However, ISF caused a superinduction of the luciferase signal above 1 µM. A superinduction is characterized by an unusually strong or heightened increase in the activity of the luciferase enzyme. This signal is not affected by the estrogen receptor antagonist 4-hydroxytamoxifen (4-OH-TAM), which was additionally used to verify whether the increase of signal is a true reflection of receptor activation. This superinduction was observed in all combinations of ZEN and α-ZEL with ISFs. Contrary to the luciferase activity findings, RT-qPCR experiments and a stability approach revealed lower real ERα activation by ISFs than measured in the ONE-Glo™ luciferase test system. In conclusion, the OECD protocol 455 appears unsuitable for testing ISFs due to their superinduction of luciferase and interactions with the test system, resulting in experimental artifacts. Further studies are necessary to explore structure–activity relationships within polyphenols and clarify the test system’s applicability.

Equol

HeLa

10.1007/s12550-023-00506-1

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