ABSTRACT The expression of a membrane-anchored gp41-derived peptide (M87) has been shown to confer protection from infection through human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) (Hildinger et al., J. Virol. 75: 3038-3042, 2001). In an effort to characterize the mechanism of action of this membrane-anchored peptide in comparison to the soluble peptide T-20, we selected resistant variants of HIV-1 NL4-3 and HIV-1 BaL by serial virus passage using PM1 cells stably expressing peptide M87. Sequence analysis of the resistant isolates showed different patterns of selected point mutations in heptad repeat regions 1 and 2 (HR1 and HR2, respectively) for the two viruses analyzed. For HIV-1 NL4-3 a single amino acid change at position 33 in HR1 (L33S) was selected, whereas for HIV-1 BaL the majority of the sequences obtained showed two amino acid changes, one in HR1 and one in HR2 (I48V/N126K). In both selections the most important contiguous 3-amino-acid sequence, GIV, within HR1, associated with resistance to soluble T-20, was not changed. Site-directed mutagenesis studies confirmed the importance of the characterized point mutations to confer resistance to M87 as well as to soluble T-20 and T-649. Replication capacity and dual-color competition assays revealed that the double mutation I48V/N126K in HIV-1 BaL results in a strong reduction of viral fitness, whereas the L33S mutation in HIV-1 NL4-3 did enhance viral fitness compared to the respective parental viruses. However, the selected point mutations did not confer resistance to the more recently described optimized membrane-anchored fusion inhibitor M87o (Egelhofer et al., J. Virol. 78: 568-575, 2004), strengthening the importance of this novel antiviral concept for gene therapy approaches.
Die von gp41 abgeleiteten Peptide T-20 und C46-B inhibieren die fur den HIV-Eintritt essentielle Fusion der viralen mit der zellularen Membran. Der in dieser Arbeit durchgefuhrte Vergleich der antiretroviralen Aktivitat der membranverankerten Fusionsinhibitoren C46-A, C46-B und C46-C sollte zur Definition der Aminosauresequenz eines optimierten membranverankerten Fusionsinhibitors fuhren. Es wurde gezeigt, dass mit C46-B bereits ein sehr effektiver und gegen ein breites Spektrum an HIV-Primarisolaten sowie T-20 insensitiven HIV-1-Klonen wirksamer membranverankerter Fusionsinhibitor existiert. Die subtypspezifischen C46-Derivate C46-A und C46-C wiesen gegenuber C46-B keinen signifikanten Vorteil auf. In einem zweiten Teilprojekt wurde die Resistenzentwicklung gegen mT-20 und C46-B untersucht. Allerdings war es nicht moglich, gegen C46-B resistenten HIV-1-Varianten zu selektieren, was die Bedeutung dieses membranverankerten Fusionsinhibitors fur die Gentherapie von HIV-Infizierten unterstreicht. Die Resistenz gegen mT-20, die bei selektierten BaL- und NL4.3-Varianten beobachtet wurde, wurde von einem in HR2 liegenden Aminosaureaustausch (BaL, N126K) bzw. einem in HR1 liegenden Aminosaureaustausch (NL4.3, L33S) vermittelt. Im Fall von BaL trat gleichzeitig eine Punktmutation in HR1 (I48V) auf, die die Resistenz moduliert. Obwohl keine dieser Mutationen im mit T-20 Resistenz assoziierten Motiv lag, war die Empfindlichkeit beider selektierten Varianten gegenuber loslichem T-20 herabgesetzt, was darauf schliesen lasst, dass sich die Wirkmechanismen der membranverankerten und loslichen Peptide ahneln. Die I48V- und N126K-Mutationen in BaL fuhrten zu einer herabgesetzten viralen Fitness, was vermutlich auf eine schnellere HR1/HR2-Interaktion zuruckzufuhren ist. Der im Gegensatz dazu durch den L33S-Austausch in NL4.3 vermittelte Fitnessvorteil wird wahrscheinlich dadurch ermoglicht, dass die Mutation die Funktion des RRE nicht beeintrachtigt und die HR1/HR2-Bindung verbessert.
