The enzyme telomerase regulates telomere length by synthesis of telomeric repeats to compensate for telomeric loss in each DNA replication cycle. Therefore, telomerase is a potential target to block growth of cells with high replication rates. In Plasmodium falciparum, telomerase activity has been documented, but little information on its structure and role.Herein, alignment of multiple sequences was undertaken comparing telomerase catalytic subunit sequences as found in existing databases. A consensus sequence was compared with the sequences in the P. falciparum genome project and as a result, a candidate sequence for a portion of the telomerase gene was recovered. Primer sets were designed for DNA and RNA amplifications.DNA fragments corresponding to telomerase conserved domains were amplified by using reverse transcription and PCR of cDNA. With a combination of bioinformatics and sequencing methods, the sequence of telomerase catalytic subunit gene (TERT) in P. falciparum was discovered, and its presence and transcription demonstrated.
A simple, quick and sensitive method was used to detect telomerase activity in Plasmodium falciparum. The telomeric repeat amplification protocol (TRAP assay) was modified using electrophoresis and staining with SYBR-green I to detect telomerase activity in a range of 10² to 10(7) parasites. This might be a useful way to ascertain telomerase activity in different types of nontumor cells.
Debido a la aparicion y dispersion de parasitos de Plasmodium resistentes a los medicamentos de mayor uso, la malaria es hoy por hoy uno de los mas serios problemas de salud publica. Considerando la dificultad intrinseca de adelantar estudios «in vivo», las pruebas «in vitro» han sido una estrategia alterna para establecer la situacion y la magnitud de la resistencia en un area especifica. En P. falciparum la resistencia “in vitro” a pirimetamina y sulfadoxina parece estar determinada por mutaciones en los genes que codifican para sus respectivas enzimas blanco: dihidrofolato reductasa (DHFR) y dihidropteroato sintetasa (DHPS). En DHFR las mutaciones Asn108 y Thr108 estan asociadas con perdida de sensibilidad «in vitro» a pirimetamina y cicloguanil respectivamente, la mutacion Arg59 modula el nivel de resistencia «in vitro» a pirimetamina y la mutacion Leu164 confiere resistencia a los dos medicamentos cuando se suma a Asn108 y Arg59. Sobre DHPS tambien se han encontrado mutaciones posiblemente involucradas en resistencia a sulfadoxina: Phe436, Ala436, Thr613 y Ser613 entre otras. Se analizaron 55 muestras sanguineas (extendidos) de pacientes infectados con P. falciparum provenientes de Pangui-Choco*, haciendo extraccion de ADN y amplificando los genes DHFR y DHPS mediante reaccion en cadena de la Polimerasa (PCR); posteriormente y por medio de PCR anidado, se determino la presencia de las mutaciones Asn108 y Thr108 para todos los aislamientos y de las mutaciones Arg59, Leu164, Phe436, Ala436, Thr613 y Ser613 para algunos de ellos. Aunque el 43% de la poblacion presento la mutacion asociada con resistencia «in vitro» a pirimetamina (Asn108), no se ha reportado una falla terapeutica tan alta en la zona. La explicacion puede residir en que la mutacion Asn108 por si sola no es suficiente para determinar resistencia «in vivo» a pirimetamina y por tanto es necesario que existan otras mutaciones en DHFR para producir resistencia al medicamento. Se ha sugerido que la mutacion Arg59 puede tener un papel determinante en la resistencia a pirimetamina; si este fuera el caso, entonces la resistencia al medicamento dentro de la poblacion estudiada seria cercana al 18% (muestras con Asn108 y Arg59 simultaneamente). Aunque el cicloguanil no es un medicamento muy utilizado en nuestro pais, la mutacion asociada con resistencia a este farmaco se presento en un 37% de las muestras (Thr108); sin embargo, se descarto la posible resistencia simultanea a pirimetamina y cicloguanil, debido a la ausencia de la mutacion Leu164 en estos aislamientos. No se encontraron parasitos con mutaciones en las posiciones 436 o 613 de DHPS. Finalmente y usando como marcador molecular la posicion 108 del gen de DHFR, se encontro que casi el 50% de las muestras analizadas eran infecciones mixtas (muestras con mas de una poblacion de P. falciparum); este tipo de analisis permite detectar la heterogeneidad de los parasitos circulantes y relacionar patrones geneticos con ubicacion geografica. En conclusion, el acercamiento experimental hecho en este estudio permitio no solo establecer la frecuencia de algunas mutaciones relacionadas con resistencia «in vitro» a pirimetamina y sulfadoxina, sino tambien abrio la posibilidad de usar estos genes como marcadores moleculares para establecer el polimorfismo de la poblacion de P. falciparum. *Colectadas entre agosto y septiembre de 1997 por la Corporacion de Investigaciones Biologicas de Medellin y gentilmente suministradas por el Dr. William Rojas.
Colombian field isolates of Plasmodium falciparum were analyzed for genetic diversity. Fifty-three samples were collected as thick smears from patients living in PanguÃ, an isolated area with low migration. While the samples were being collected, Panguà was experiencing an epidemic outbreak of malaria. The samples were typified using nested polymerase chain reaction (PCR) amplification of block 2 of the merozoite surface protein 1 (MSP1) gene and nested PCR with mutation-specific primers for position 108 of the dihydrofolate reductase enzyme gene. The results for the circulating population of parasites in Panguà show low diversity--four allelic forms--using MSP1 as a marker, a fact that contrasts with data reported for certain Asian and African zones. A high percentage of mixed infections was observed, as was high complexity of the infection. No differential distributions were found for any allelic type.