The accumulation of amyloid β peptide(1–42) (Aβ(1–42)) in extracellular plaques is one of the pathological hallmarks of Alzheimer disease (AD). Several studies have suggested that cellular reuptake of Aβ(1–42) may be a crucial step in its cytotoxicity, but the uptake mechanism is not yet understood. Aβ may be present in an aggregated form prior to cellular uptake. Alternatively, monomeric peptide may enter the endocytic pathway and conditions in the endocytic compartments may induce the aggregation process. Our study aims to answer the question whether aggregate formation is a prerequisite or a consequence of Aβ endocytosis. We visualized aggregate formation of fluorescently labeled Aβ(1–42) and tracked its internalization by human neuroblastoma cells and neurons. β-Sheet-rich Aβ(1–42) aggregates entered the cells at low nanomolar concentration of Aβ(1–42). In contrast, monomer uptake faced a concentration threshold and occurred only at concentrations and time scales that allowed Aβ(1–42) aggregates to form. By uncoupling membrane binding from internalization, we found that Aβ(1–42) monomers bound rapidly to the plasma membrane and formed aggregates there. These structures were subsequently taken up and accumulated in endocytic vesicles. This process correlated with metabolic inhibition. Our data therefore imply that the formation of β-sheet-rich aggregates is a prerequisite for Aβ(1–42) uptake and cytotoxicity. The accumulation of amyloid β peptide(1–42) (Aβ(1–42)) in extracellular plaques is one of the pathological hallmarks of Alzheimer disease (AD). Several studies have suggested that cellular reuptake of Aβ(1–42) may be a crucial step in its cytotoxicity, but the uptake mechanism is not yet understood. Aβ may be present in an aggregated form prior to cellular uptake. Alternatively, monomeric peptide may enter the endocytic pathway and conditions in the endocytic compartments may induce the aggregation process. Our study aims to answer the question whether aggregate formation is a prerequisite or a consequence of Aβ endocytosis. We visualized aggregate formation of fluorescently labeled Aβ(1–42) and tracked its internalization by human neuroblastoma cells and neurons. β-Sheet-rich Aβ(1–42) aggregates entered the cells at low nanomolar concentration of Aβ(1–42). In contrast, monomer uptake faced a concentration threshold and occurred only at concentrations and time scales that allowed Aβ(1–42) aggregates to form. By uncoupling membrane binding from internalization, we found that Aβ(1–42) monomers bound rapidly to the plasma membrane and formed aggregates there. These structures were subsequently taken up and accumulated in endocytic vesicles. This process correlated with metabolic inhibition. Our data therefore imply that the formation of β-sheet-rich aggregates is a prerequisite for Aβ(1–42) uptake and cytotoxicity.
Influenza A besitzt ein segmentiertes, achtstrangiges Genom in negativer Orientierung. Die einzelnen Segmente sind in virale Ribonukleoproteinkomplexe (vRNPs) verpackt. Genomische Segmentierung erlaubt es Influenza, zwischen verschiedenen Stammen Reassortierung zu betreiben, was zur Entstehung von hochgradig virulenten und potentiell pandemischen neuen Stammen fuhren kann. Die Existenz eines Packungsmechanismus wird vermutet, der sicherstellt dass exakt ein Segment jeden Typs in neu knospende Viren verpackt wird. Es gibt Indizien dafur, dass die vRNPs wahrend ihres Wegs vom Nukleus zur Plasmamembran, wo die Knospung stattfindet, Multi-Segment-Komplexe ausbilden, die durch RNA-RNA-Interaktionen, sog. Packungssignale vermittelt werden. Dieser Prozess ist allerdings noch nicht hinreichend verstanden. In dieser Arbeit wurde eine neue RNA-FISH-Methode namens MuSeq-FISH entwickelt und angewendet, um die spektralen Limitierungen bisheriger Multiplexing-Ansatze zu uberwinden und alle vRNA- und mRNA-Spezies vom humanen Stamm A/Panama des Influenza A Virus zu visualisieren. Auserdem wurde ein automatisierter Arbeitsablauf zur Registrierung/Ausrichtung, Punktdetektion, computergestutzter Kolokalisationsanalyse und kombinatorischer Analyse der Mikroskopiebilder entwickelt, der auch grose Datenmengen verarbeiten kann. Erstmalig wurde damit eine vollstandige Kartographierung der Lokalisation und Haufigkeiten alle viralen RNAs in einzelnen Zellen vorgenommen. Aus diesen Daten konnten wir Erkenntnisse zu den Mechanismen und moglichen Hierarchien innerhalb des Packungsprozesses gewinnen. Dazu wurden Reaktionspfade und statistische Analysen von uber 60 einzelnen Zellen und mehr als 105 einzelner vRNPs herangezogen. Es wurden auch Informationen uber die vRNP-Haufigkeiten und deren Unterschiede zwischen Einzelzellen gewonnen, die zeigen dass sich Infektionsumgebungen auch in groser raumlicher Nahe stark unterscheiden und dadurch den Verpackungsmechanismus beeinflussen konnen. Weiterhin wurde eine Modellierung basierend auf bedingten Wahrscheinlichkeiten genutzt, um Reaktionskonstanten aus statischen FISH-Daten zu erhalten. Wir haben unsere Analysen zusatzlich auf den aviaren Stamm A/Mallard und die reassortanten Stamme A/Pan-M, A/Pan-NS und A/Pan-NSM erweitert, die ein gemischtes Genom aus A/Panama und A/Mallard enthalten. Dabei konnte gezeigt werden, dass sich die Packungsdynamiken und -netzwerke auch zwischen nah verwandten Stammen erheblich unterscheiden. Heterogene Verpackungsprozesse wurden fur diese Stamme observiert, anhand welcher A/Pan-M und A/Pan-NS eher A/Mallard zugeordnet werden konnten. Ebenfalls wurden erste Schritte unternommen, um die Methode in verschiedener Hinsicht zu erweitern: es zeigte sich, dass MuSeq-FISH und STED-Mikroskopie im Prinzip kombinierbar sind, was auch durch gleichzeitige Detektion von drei vRNA-Segmenten gezeigt werden konnte. MuSeq-FISH wurde auch genutzt, um einzelne Virionen direkt nach deren Eintritt in die Zelle zu farben und auf deren genomischen Inhalt hin zu untersuchen. Dabei fiel auf, dass die Segmente 7 und 8 besonders haufig fehlten, wenn unvollstandige Genome detektiert wurden. Auserdem wurde ein Plasmidsystem auf Basis des pHW2000-Vektors fur fast alle Segmente von A/Panama umkloniert, welches nun die Expression von mRNA ohne die gleichzeitige Expression von vRNA ermoglicht. In einem ersten Experiment konnte die Funktionalitat des Systems gezeigt werden, so dass es potentiell in Transfektionsexperimenten die Untersuchung vom Packungsmechanismus ermoglichen kann, und zwar unter infektionsahnlichen Bedingungen mit beliebig kombinierbaren vRNA-Sets. Wir erwarten, dass MuSeq-FISH zusammen mit dem automatisierten Arbeitsablauf auch eine nutzliche Methode fur andere biologische Fragestellungen darstellen wird, besonders wenn es um hochgradig kolokalisierte Untersuchungsobjekte geht. Fundiertes Wissen uber den Packungsmechanismus von Influenzaviren kann helfen, die Entstehung von pandemischen Stammen besser zu verstehen und kann Moglichkeiten aufzeigen, neue antivirale Medikamente zu entwickeln.
The influenza A virus (IAV) genome is segmented into eight viral ribonucleoproteins, each expressing a negatively oriented viral RNA (vRNA). Along the infection cycle, highly abundant single-stranded small viral RNAs (svRNA) are transcribed in a segment-specific manner. The sequences of svRNAs and of the vRNA 5'-ends are identical and highly conserved among all IAV strains. Here, we demonstrate that these sequences can be used as a target for a pan-selective sensor of IAV infection. To this end, we used a complementary fluorescent forced-intercalation RNA (IAV QB-FIT) probe with a single locked nucleic acid substitution to increase brightness. We demonstrated by fluorescence in situ hybridization (FISH) that this probe is suitable and easy to use to detect infection of different cell types by a broad variety of avian, porcine, and human IAV strains, but not by other influenza virus types. IAV QB-FIT also provides a useful tool to characterize different infection states of the host cell.
Abstract The genome of influenza A viruses (IAV) is encoded in eight distinct viral ribonucleoproteins (vRNPs) that consist of negative sense viral RNA (vRNA) covered by the IAV nucleoprotein. Previous studies strongly support a selective packaging model by which vRNP segments are bundling to an octameric complex, which is integrated into budding virions. However, the pathway(s) generating a complete genome bundle is not known. We here use a multiplexed FISH assay to monitor all eight vRNAs in parallel in human lung epithelial cells. Analysis of 3.9 × 10 5 spots of colocalizing vRNAs provides quantitative insights into segment composition of vRNP complexes and, thus, implications for bundling routes. The complexes rarely contain multiple copies of a specific segment. The data suggest a selective packaging mechanism with limited flexibility by which vRNPs assemble into a complete IAV genome. We surmise that this flexibility forms an essential basis for the development of reassortant viruses with pandemic potential.
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