SUMMARY Octopine dehydrogenase (OcDH) from the adductor muscle of the great scallop, Pecten maximus (Linné, 1758), catalyses the NADH-dependent condensation of l-arginine and pyruvate to d-octopine, NAD+ and water during escape swimming and subsequent recovery. During exercise, ATP is mainly provided by the transphosphorylation of phospho-l-arginine and to some extent by anaerobic glycolysis. NADH resulting from the glycolytic oxidation of 3-phosphoglyceraldehyde to 1,3-bisphosphoglycerate is reoxidized during d-octopine formation. In some scallops d-octopine starts to accumulate during prolonged, strong muscular work, whereas in other species d-octopine formation commences towards the end of swimming and continues to rise during subsequent recovery. The activity of OcDH is regulated by a mandatory, consecutive mode of substrate binding in the order NADH, l-arginine and pyruvate, as demonstrated by isothermal titration calorimetry. The first regulatory step in the forward reaction comprises the binding of NADH to OcDH with a dissociation constant Kd of 0.014±0.006 mmol l–1, which reflects a high affinity and tight association of the apoenzyme with the co-substrate. In the reverse direction, NAD+ binds first with a Kd of 0.20±0.004 mmol l–1 followed by d-octopine. The binary OcDH–NADH complex associates with l-arginine with a Kd of 5.5±0.05 mmol l–1. Only this ternary complex combines with pyruvate, with an estimated Kd of approximately 0.8 mmol l–1 as deduced from pyruvate concentrations determined in the muscle of exhausted scallops. At tissue concentrations of pyruvate between 0.5 and 1.2 mmol l–1 in the valve adductor muscle of fatigued P. maximus, binding of pyruvate to OcDH plays the most decisive role in initiating OcDH activity and, therefore, in controlling the onset of d-octopine formation.
Octopine dehydrogenase (OcDH) from the adductor muscle of the great scallop, Pecten maximus, catalyzes the NADH dependent, reductive condensation of L-arginine and pyruvate to octopine, NAD+, and water during escape swimming and/or subsequent recovery. The structure of OcDH was recently solved and a reaction mechanism was proposed which implied an ordered binding of NADH, L-arginine and finally pyruvate. Here, the order of substrate binding as well as the underlying conformational changes were investigated by NMR confirming the model derived from the crystal structures. Furthermore, the crystal structure of the OcDH/NADH/agmatine complex was determined which suggests a key role of the side chain of L-arginine in protein cataylsis. Thus, the order of substrate binding to OcDH as well as the molecular signals involved in octopine formation can now be described in molecular detail.
Opindehydrogenasen terminieren im Energiestoffwechsel verschiedener mariner Invertebraten die anaerobe Glykolyse, indem sie die reduktive Kondensation einer Aminosaure mit Pyruvat oder einer anderen alpha-Ketosaure zu einem Opin und Wasser katalysieren, wobei NADH zu NAD+ reoxidiert wird. Bei Vertebraten sowie bei Crustaceen, Spinnen und Insekten ubernimmt die Laktatdehydrogenase diese Aufgabe. Wie bei diesen Tieren die LDH, stellt bei vielen Mollusken die Oktopindehydrogenase einen adaptiven Mechanismus in Flucht- und Kampfreaktionen dar. Zur Aufklarung der Struktur und des molekularen Reaktionsmechanismus der alternativen Pyruvatoxidoreduktasen erwies sich die Oktopindehydrogenase als besonders geeignet, da nach Aufklarung der Primarstruktur und heterologer Expression in E. coli das Enzym in ausreichender Menge und homogen zur Verfugung stand (Jansen, 2000). Obwohl biochemisch bereits gut charakterisiert, gibt es uber den Reaktionsmechanismus der ODH jedoch widerspruchliche Informationen. Durch einen Vergleich der thermodynamischen Parameter fur die Substratbindung an ODH und LDH sollten einerseits der kinetische Mechanismus der ODH-Reaktion identifiziert und andererseits die Frage nach einem Selektionsvorteil durch den Besitz alternativer Pyruvatoxidoreduktasen fur die verschiedenen marinen Invertebraten zumindest ansatzweise geklart werden. Die thermodynamische Analyse der Substratbindung an die rekombinante Oktopindehydrogenase hat gezeigt, dass diese nach einem geordnet-sequenziellen Mechanismus erfolgt. An das freie Enzym bindet zuerst die reduzierte Form des Coenzyms, NADH, wodurch eine Konformationsanderung hervorgerufen wird, welche die Bindung des ersten Substrats, L-Arginin, ermoglicht. Durch die Bindung des L-Arginins wird wiederum eine Konformationsanderung induziert, welche die Bindung des zweiten Substrats, Pyruvat, gestattet. Dadurch werden die Substrate in die raumliche Nahe des Nikotinamidrings gebracht. Erst dann ist der Hydridtransfer auf den Ubergangszustand moglich, dem aus Pyruvat und L-Arginin gebildeten Imin. Sowohl die Substrate L-Arginin und Pyruvat als auch D-Oktopin konnen mit dem jeweils komplementaren binaren Komplex sogenannte dead-end-Komplexe bilden, die womoglich eine Rolle bei der Regulation der Enzymaktivitat spielen. Sowohl bei der LDH (Clark et al., 1989) als auch bei der ODH ist eine His-Asp-Arg-Triade an der Pyruvat-Bindung und an der Katalyse masgeblich beteiligt (Jansen, 2000; Muller, personliche Mitteilung). Trotzdem unterscheiden sich beide Dehydrogenasen in ihrer Affinitat zum Substrat Pyruvat. Wahrend Pyruvat mit einer hohen Affinitat an einen binaren LDHNADH-Komplex bindet, war eine Bindung an einen ODHNADH-Komplex nicht detektierbar. Es ist wahrscheinlich die L-Arginin-induzierte Konformationsanderung, welche die katalytische Triade in die fur die Pyruvat-Bindung essentielle hydrophobe Umgebung bringt. Der kinetische Mechanismus der ODH-Reaktion ist also darauf ausgelegt, die Entstehung von L-Laktat in einem putativen ODHNADHPyruvat-Komplex zu verhindern. Neben der Regenerierung von Reduktionsaquivalenten wird durch die ODH-Reaktion auch die Konzentration freien L-Arginins verringert. In den Geweben mariner Lebewesen kommen freie Aminosauren oft in hohen Konzentrationen vor, da sie diese fur die Osmoregulation benotigen. Hohe Argininkonzentrationen haben sich dabei als ungunstig fur den Organismus erwiesen. Aufgrund seiner positiven Nettoladung geht L-Arginin vielfach Wechselwirkungen mit den verschiedensten Metaboliten ein und hemmt Enzymaktivitaten. D-Oktopin hingegen zeigt diesen Effekt nicht (Bowlus und Somero, 1979). Durch die Bildung von D-Oktopin konnten demnach, neben der Regenerierung von Reduktionsaquivalenten wahrend starker Muskelaktivitat, auch storende, hohe L-Argininkonzentrationen im Organismus vermieden werden. Offenbar scheint dieses fur marine Invertebraten der einzige Vorteil der Oktopindehydrogenase gegenuber der Laktatdehydrogenase zu sein.
