Abstract Wie der Weg von der Grundlagenforschung über ein Enzym zur schnellen Diagnostik des Virus Sars‐CoV‐2 mit Echtzeit‐Polymerase‐Kettenreaktion führte.
Abstract Durch Erkennung von Form und Geometrie des naszierenden Nukleotidpaars stellen DNA‐Polymerasen die hohe Selektivität der DNA‐Replikation sicher. Man geht davon aus, dass DNA‐Polymerasen mit hoher Replikationsgenauigkeit hierzu ein genau angepasstes aktives Zentrum enthalten, das nur geringe Abweichungen von den kanonischen Basenpaarungen toleriert. Dennoch ist bekannt, dass DNA‐Polymerasen Nukleotide mit kleinen Modifikationen als Substrate akzeptieren, was von wesentlicher Bedeutung für zahlreiche grundlegende biotechnologische Anwendungen ist. Hier wird nun gezeigt, dass selbst DNA‐Polymerasen, die eine hohe Replikationsgenauigkeit aufweisen, in der Lage sind, eine Nukleotid‐Chimäre, die mit einem großen Protein wie der Meerrettichperoxidase modifiziert ist, als Substrat zu nutzen, obwohl diese “Fracht” um ein Hundertfaches größer ist als das natürliche Substrat. Wir nutzten diese Eigenschaft, um ein Testsystem zu entwickeln, das den Nachweis von DNA und RNA in Einzelbasenauflösung mit bloßem Auge ermöglicht.
LAMP is an approach for isothermal nucleic acids diagnostics with increasing importance but suffers from the need of tedious systems design and optimization for every new target. Here, we describe an approach for its simplification based on a single nucleoside-5′-O-triphosphate (dNTP) that is covalently modified with a DNA strand. We found that the DNA-modified dNTP is a substrate for DNA polymerases in versatile primer extension reactions despite its size and that the incorporated DNA indeed serves as a target for selective LAMP analysis.
Abstract DNA polymerases select the right nucleotide for the growing polynucleotide chain based on the shape and geometry of the nascent nucleotide pairs and thereby ensure high DNA replication selectivity. High‐fidelity DNA polymerases are believed to possess tight active sites that allow little deviation from the canonical structures. However, DNA polymerases are known to use nucleotides with small modifications as substrates, which is key for numerous core biotechnology applications. We show that even high‐fidelity DNA polymerases are capable of efficiently using nucleotide chimera modified with a large protein like horseradish peroxidase as substrates for template‐dependent DNA synthesis, despite this “cargo” being more than 100‐fold larger than the natural substrates. We exploited this capability for the development of systems that enable naked‐eye detection of DNA and RNA at single nucleotide resolution.
